反復(fù)調(diào)試參數(shù)、類器官批量死亡、編輯效率低迷？類器官具有致密結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞類型多樣的特征，使得類器官的基因編輯不同于傳統(tǒng)2D細(xì)胞編輯。
因此，類器官基因編輯實(shí)操篇來啦！全流程手把手解說、疑難問題解答，帶你速通類器官基因編輯的實(shí)操應(yīng)用。
類器官基因編輯實(shí)驗(yàn)流程
本流程以人胎兒肝細(xì)胞類器官為例，采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，適用于質(zhì)粒及RNP形式的CRISPR工具，全程約6-8周[1]。
01 DNA/RNP混合物制備（15 min）
-
將敲除/敲入所需質(zhì)粒加入1.5 mL無菌離心管，每反應(yīng)最多使用20 μg DNA（溶于20 μL PBS）；
-
若使用RNP復(fù)合物，按Cas9:gRNA=1:1-1:5的摩爾比混合[2]。室溫孵育15 min，確保RNP充分形成
ps：質(zhì)粒摩爾比需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整，RNP孵育時(shí)間不可過長，避免活性降低。
02 類器官樣本制備（1-2 h）
-
選取傳代后4-5天、直徑100-200 μm的類器官（12孔板至少2孔）；
-
吸棄培養(yǎng)基，每孔加1 mL預(yù)冷Wash Buffer清洗；
ps：Wash Buffer: 500 mL AdDMEM/F12 培養(yǎng)基中加入5 mL 10,000 U/mL青霉素-鏈霉素溶液、5 mL 1 M HEPES和5 mL 100× GlutaMAX 補(bǔ)充劑。
-
吹散基質(zhì)膠滴，將混合物轉(zhuǎn)移至15mL離心管，4℃ 400 g離心5 min；
-
棄上清，加2 mL 的Accutase重懸，37℃水浴孵育3-5 min并間斷吹打；
-
顯微鏡下確認(rèn)解離為單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)后，加10 mL冰冷Wash Buffer終止消化；
-
4℃ 400 g離心5 min，重復(fù)清洗2次，最終用130 μL的 Opti-MEM重懸；
-
加入制備好的DNA/RNP混合物，室溫孵育3 min。
ps：解離前需測試細(xì)胞生長能力，若單細(xì)胞生長差，可保留小細(xì)胞團(tuán)；所有離心步驟需4℃進(jìn)行，保護(hù)細(xì)胞活性。
03 電穿孔轉(zhuǎn)染（1-2 h）
-
將細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)移至電穿孔比色皿中；
-
設(shè)置NEPA21電轉(zhuǎn)儀參數(shù)：穿孔脈沖：175 V，7.5 ms，間隔50 ms，2次脈沖，轉(zhuǎn)移脈沖：20 V，50 ms，間隔50 ms，5次脈沖；
-
電轉(zhuǎn)后立即加入750 μL Isolation HEP培養(yǎng)基，室溫恢復(fù)20 min；
ps：Isolation HEP培養(yǎng)基：100mL HEP 培養(yǎng)基，添加 ROCK 抑制劑（Y-27632），使其最終濃度為10 μM。
-
轉(zhuǎn)移至含8 mL預(yù)冷Wash Buffer的離心管，4℃ 400 g離心5 min；
-
用適量基質(zhì)膠重懸細(xì)胞，滴入預(yù)熱的培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)箱放置30 min使膠凝固；
-
加入預(yù)熱的Isolation HEP培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
ps：基質(zhì)膠需全程冰存防止凝固；不同品牌電轉(zhuǎn)儀參數(shù)差異大，需提前優(yōu)化。
04 類器官篩選與克隆建立(6-8周)
-
電轉(zhuǎn)24 h后：觀察細(xì)胞狀態(tài)，若轉(zhuǎn)染熒光質(zhì)粒，可檢測GFP/mCherry陽性信號；
-
3-5天后：更換為普通HEP培養(yǎng)基，此時(shí)可見小細(xì)胞團(tuán)形成；
-
7-12天后進(jìn)行初步篩選：
-
熒光篩選：挑選熒光陽性類器官；
-
藥物篩選：添加10 μM的Nutlin-3a（TP53突變）或100 ng/mL的Hygromycin B（抗性基因）；
-
-
10-20天后：挑取直徑>100 μm的陽性類器官，用Accutase輕微解離后擴(kuò)大培養(yǎng)；
-
4-6周后：類器官直徑達(dá)100-250 μm，可進(jìn)行傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
05 單細(xì)胞FACS分選(4 h)
電轉(zhuǎn)3-5天后，若類器官單細(xì)胞生長能力良好，可通過FACS分選富集陽性細(xì)胞：
-
將類器官解離為單細(xì)胞，用2 mL冰冷Wash Buffer重懸；
-
100 μm濾器過濾至FACS管，4℃ 400 g離心5 min；
-
500 μL FACS緩沖液重懸，分選陽性細(xì)胞；
-
將分選細(xì)胞用基質(zhì)膠接種于24孔板，用Isolation HEP培養(yǎng)基培養(yǎng)。
培養(yǎng)鑒定：如何確認(rèn)編輯成功？
關(guān)鍵鑒定方法
典型結(jié)果展示
-
電轉(zhuǎn)2天后：明視野下可見存活細(xì)胞團(tuán)，熒光視野下觀察到瞬時(shí)熒光信號。
-
篩選2周后：藥物篩選組可見耐藥類器官存活，對照組完全死亡。
-
克隆建立后：形成形態(tài)均一、大小穩(wěn)定的基因編輯類器官系。
圖1 電轉(zhuǎn)染后的類器官[1]
問題排查
掃碼免費(fèi)獲取詳細(xì)完整版《類器官基因編輯手冊》
類器官基因編輯產(chǎn)品解決方案
近岸蛋白可提供經(jīng)類器官培養(yǎng)驗(yàn)證的產(chǎn)品解決方案，涵蓋50+類器官因子，30+類器官培養(yǎng)基，NovoMatrix® 基質(zhì)膠和配套培養(yǎng)試劑，確保批次培養(yǎng)穩(wěn)定可控，構(gòu)建無憂！
在基因編輯應(yīng)用場景可提供CRISPR/Cas系統(tǒng)的RNP體系開發(fā)的Cas蛋白及其突變體，再加上通用型一步法sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，快速制備CRISPR/Cas系統(tǒng)所需的兩大元件，可以實(shí)現(xiàn)即時(shí)快速的基因編輯。
類器官培養(yǎng)無憂包，尊享“1+3”會員禮遇
基因編輯產(chǎn)品推薦
參考文獻(xiàn)
[1] Hendriks, D., Artegiani, B., Hu, H., Chuva de Sousa Lopes, S. & Clevers, H. Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR-Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver. Nat Protoc 16, 182–217 (2021).
[2] Seki, A. & Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med 215, 985–997 (2018).