【答疑解惑】類器官培養(yǎng)100問-上篇50問
類器官是能夠在體外三維培養(yǎng)，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)”。雖然對于類器官的研究日趨成熟，但大家總會有這樣那樣的小困惑：為什么要用上皮細(xì)胞培養(yǎng)？為什么培養(yǎng)基的成分這么復(fù)雜？
近岸蛋白憑借構(gòu)建類器官平臺的實踐經(jīng)驗和深厚的文獻(xiàn)積累，圍繞類器官培養(yǎng)基本操作（基礎(chǔ)篇），腫瘤類器官培養(yǎng)（PDO篇），以及類器官應(yīng)用等多個主題方向，精心整理了類器官培養(yǎng)常見問題100問，今天為大家?guī)砩掀?/span>
基礎(chǔ)篇
Q1: 類器官培養(yǎng)對于起始細(xì)胞的來源有要求嗎？
A1: 目前培養(yǎng)的類器官主要來源于上皮細(xì)胞，對于非上皮細(xì)胞來源的類器官培養(yǎng)方式還需要進一步研究。
Q2: 類器官按照起始細(xì)胞的類型，分為幾種呢？
A2: 常見的類器官根據(jù)起始細(xì)胞的類型，可以分為兩種：
（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；
（2）干細(xì)胞來源的類器官，包括：多能性干細(xì)胞 (PSC) /成體干細(xì)胞 (ASC)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。
Q3: 類器官是由單一種類細(xì)胞組成的嗎？
A3: 類器官并不是單一細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，而是由具有干細(xì)胞性質(zhì)的起始細(xì)胞進行分裂和分化，并將多種類型的細(xì)胞自組裝的結(jié)構(gòu)，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似。
Q4：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細(xì)胞進行3D培養(yǎng)嗎？
A4：可以的。已有學(xué)者驗證過，將人結(jié)腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復(fù)蘇和原代細(xì)胞提取，分別對細(xì)胞進行2D和3D培養(yǎng)，證實了凍存對于細(xì)胞活力和生長速度均無顯著影響【1】。
當(dāng)然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據(jù)實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細(xì)胞依然是3D培養(yǎng)的最佳選擇。
Q5：類器官可以像細(xì)胞一樣進行凍存和復(fù)蘇嗎？
A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達(dá)到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。
Q6：類器官的尺寸需要進行控制嗎？
A6：是的，主要的原因是類器官內(nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。
當(dāng)類器官的尺寸較大時，靠近中心的細(xì)胞難以和外界進行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細(xì)胞就越多（見下圖）【2】。我們在培養(yǎng)的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內(nèi)。未來的類器官技術(shù)可以與血管類器官結(jié)合在一起，建立一個功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類器官。
TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細(xì)胞死亡（綠色），比例尺為100μm【2】
Q7：類器官傳代的標(biāo)準(zhǔn)是什么？
A7：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次【3】。
Q8：類器官可以進行多少次傳代？
A8：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度【4】。
Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？
A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測該類器官是否表達(dá)相應(yīng)的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。
Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的？
A10: 在進行類器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內(nèi)的發(fā)育過程，及早期發(fā)育相關(guān)的信號通路。
以胃類器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來，早期發(fā)育需要由多種信號通路共同調(diào)控。那么在體外我們需要通過添加細(xì)胞因子的方式，指導(dǎo)激活/抑制相應(yīng)的信號通路，來達(dá)到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內(nèi)胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導(dǎo)細(xì)胞向向前腸分化【5】。
PDO篇
患者來源類器官（Patient Derived Organoid, PDO）是體外評估藥物的有效模型，目前較常用于患者的個性化用藥和抗癌藥物的測試領(lǐng)域。今天小編整理了部分PDO培養(yǎng)中常遇到的問題，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>
Q11:對于病人的腫瘤組織，需要怎樣處理盡量避免污染？
A11：1、將腫瘤組織置于70%-75%乙醇中30秒，清洗表面血塊等雜物，并用剪刀對組織稍加修整。
2、放入含有青/鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素（單獨使用某一種或幾種組合）的PBS緩沖液進行進一步清洗。
3、原代細(xì)胞提取前，建議先進行支原體檢測，防止支原體污染。
Q12: PDO對于藥敏反應(yīng)的準(zhǔn)確度是怎樣的呢？
A12：有數(shù)據(jù)表明，PDO對藥敏反應(yīng)的陽性預(yù)測值（預(yù)測某一特定藥物有效）為88%，陰性預(yù)測值（預(yù)測某一特定藥物無效）為100%，敏感性達(dá)100%，特異性為93%【6】。
Q13:病灶和癌旁培養(yǎng)出的類器官有差別嗎？腫瘤組織的取材部位有什么要求？
A13：原發(fā)病灶和癌旁來源的腫瘤類器官是有差別的。
如：從形態(tài)上看，原發(fā)病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結(jié)構(gòu)【7】。
由于腫瘤具有異質(zhì)性，因此類器官存在差異也是很常見的。如果想要盡量減小建模或藥物篩選的誤差，可以考慮多點位取材。
原發(fā)病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結(jié)構(gòu)【7】
Q14：PDO培養(yǎng)的成功率是多少？成功率和是否進行治療有關(guān)系嗎？
A14：不同類型來源的PDO成功率略有不同，大部分的PDO培養(yǎng)成功率在63%-70%左右【6】，并且臨床治療對于這個統(tǒng)計結(jié)果影響不大【8】。通過縮短樣本離體時間和操作步驟，可以適當(dāng)提高成功率。
Q15：凍存多長時間內(nèi)的組織可以用于類器官培養(yǎng)？
A15：對于凍存在-80℃的組織，6周之內(nèi)復(fù)蘇并進行類器官培養(yǎng)是最佳選擇【9】。當(dāng)然如果是保存在液氮中，保存的時間可以更久一些。
Q16：原代細(xì)胞提取時，通常會混有增殖非常迅速的成纖維細(xì)胞，應(yīng)該怎樣快速去除呢？
A16：成纖維細(xì)胞主要有兩種去除方式：
1、鑒于成纖維細(xì)胞貼壁不牢的性質(zhì)，可以采用反復(fù)貼壁的方式去除大部分成纖維細(xì)胞。
2、目前已有商用的成纖維細(xì)胞去除試劑，但是否會影響類器官的培養(yǎng)還需要實驗驗證。
Q17：培養(yǎng)腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？
A17：手術(shù)組織大概需要3顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少3針，內(nèi)鏡活檢至少鉗取6顆以上。
Q18：從腫瘤組織中提取原代細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈紅色，這是為什么？
A18：紅色主要是由于腫瘤組織中的大量紅細(xì)胞所導(dǎo)致的。
首先，可以在拿到組織后盡量多清洗幾次，能夠去除大部分的紅細(xì)胞；
其次，可以使用商品化的紅細(xì)胞裂解液。紅細(xì)胞裂解液的原理是去除無核細(xì)胞，因此不會影響其他有核細(xì)胞的正常培養(yǎng)。
Q19：怎樣構(gòu)建含有PDO的腫瘤微環(huán)境？
A19：目前構(gòu)建含有PDO的腫瘤微環(huán)境主要有三種方式：
（I）將腫瘤組織經(jīng)過物理或酶解分離后，在細(xì)胞外基質(zhì)(Matrigel或BME)中進行類器官培養(yǎng)；同時分離外源性免疫細(xì)胞（通常來源于自體外周血或腫瘤組織），隨后與生長的類器官進行共培養(yǎng)。
（II）將腫瘤消化后形成的球狀組織與膠原蛋白混合，并接種到微流體培養(yǎng)裝置中，即腫瘤細(xì)胞與樣本中的固有免疫微環(huán)境共同培養(yǎng)，形成天然TME模型。
（III）將含有免疫細(xì)胞的腫瘤組織物理切割成組織碎片，在包被膠原蛋白凝膠的transwell小室中進行培養(yǎng)。凝膠的頂部暴露在空氣中，同時外皿中的培養(yǎng)基通過可滲透的transwell擴散到內(nèi)皿中，形成氣-液交互界面(air–liquid interface, ALI)。腫瘤免疫微環(huán)境的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)建立可參考“腫瘤微環(huán)境的類器官模型，助力耐藥腫瘤的治療”。
Q20：由于取到的腫瘤組織太小了，培養(yǎng)的類器官數(shù)目不足以進行后續(xù)的檢測。我可以將類器官傳代擴增嗎？
A20：對于腫瘤來源的類器官一般是不建議傳代的，因為傳代后的表型會和體內(nèi)情況略有差異。文獻(xiàn)中的PDO一般會控制在2-3代【9】，最多不超過5代【10】。
如果細(xì)胞數(shù)目太少，傳代5次依然不能滿足測試需求，可以考慮將檢測的方式改變一下，比如從96孔板換成384孔板，甚至更小體系的微流控芯片。
Q21:腫瘤組織中會存在正常細(xì)胞嗎？怎么去除這些正常細(xì)胞？
A21：即使是肉眼判斷為腫瘤的組織中，也會混有一部分正常細(xì)胞。因此在進行類器官培養(yǎng)前，可以先將原代細(xì)胞進行流式分選或磁珠分選，得到腫瘤細(xì)胞再進行類器官培養(yǎng)。
Q22: 正常細(xì)胞是否也會生長為類器官？腫瘤類器官培養(yǎng)時怎么去除正常類器官？
A22：由于腫瘤組織中通常混有一些健康細(xì)胞，因此培養(yǎng)出的腫瘤類器官很有可能混雜了來源于正常上皮的類器官。為了得到更純的PDO，除了Q1中提到的對原代細(xì)胞進行處理外，也可以對類器官群進行“純化”，主要有以下三種途徑【6】。
1、利用正常類器官和PDO的形態(tài)不同，在鏡下進行手動篩選。圖1展示了胃類器官和腫瘤類器官的形態(tài)差異：正常的胃類器官呈球形，由單層上皮細(xì)胞組成，具有較大的管腔；而腫瘤類器官通常是囊狀，且有多層細(xì)胞形態(tài)。
正常胃類器官和腫瘤類器官的鏡下形態(tài)不同，比例尺300μm【6】
2、通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的組分進行篩選。如：大多數(shù)胃癌表現(xiàn)出TP53突變，這一突變使PDO表現(xiàn)出對Nutlin-3更耐受，而正常類器官則會死亡。
3、將類器官消化為單個細(xì)胞后，流式分選出腫瘤細(xì)胞。
腫瘤類器官的單細(xì)胞流式分選，比例尺400 μm【6】
Q23:進行藥敏實驗時，需要將PDO從基質(zhì)膠中消化下來嗎？
A23：可能有很多小伙伴擔(dān)心基質(zhì)膠會阻礙藥物進入到PDO中，但無數(shù)實驗已經(jīng)證明，基質(zhì)膠內(nèi)的PDO是可以對藥物進行響應(yīng)的；而且PDO需要三維結(jié)構(gòu)才能模擬體內(nèi)狀況，如果沒有了基質(zhì)膠的支撐，藥敏實驗的準(zhǔn)確性會打折扣。
Q24：PDO實驗可以代替動物模型（PDX）嗎？
A24：PDO相較于動物模型有很多優(yōu)點，例如成本低、耗時短、可以進行大規(guī)模培養(yǎng)和實驗等。不過在藥物代謝、癌癥的浸潤、轉(zhuǎn)移等方向的研究則需要動物實驗來進行。
Q25：在培養(yǎng)過程中，PDO生長情況與之前相比異常，主要表現(xiàn)為生長周期變短，增殖迅速，這是什么原因？
A25：如果PDO在培養(yǎng)過程中突然增殖迅速，可能是某些雜質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）的大量生長導(dǎo)致的，此時最好進行切片染色，觀察一下是否存在這些細(xì)胞的污染。如果不是這個原因，則考慮是突變引起的，最好進行測序驗證并與初代PDO進行比對。
Q26：怎樣檢測PDO對藥物的敏感性？
A26：主要有兩種途徑進行檢測。
1、進行細(xì)胞活力檢測，即線粒體呼吸（耗氧率）、糖酵解 （H+濃度）等；
2、可以通過高內(nèi)涵成像技術(shù)進行分析。
Q27：PDO和腫瘤原代細(xì)胞的藥敏實驗濃度范圍相同嗎？
A27：小編查閱了大量的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PDO的藥物測試有效濃度會整體高于2D細(xì)胞，不同種類的PDO之間也存在很大的倍數(shù)差異。
Q28：PDO模型可以進行抗體類藥物篩選嗎？
A28：由于抗體類藥物需要免疫細(xì)胞的參與，因此單純的PDO模型并不適合。可以考慮在PDO的基礎(chǔ)上建立腫瘤微環(huán)境（TME），從而進行抗體類藥物的測試。
Q29：腫瘤細(xì)胞系（如Hela細(xì)胞系）可以培養(yǎng)成為PDO嗎？
A29：不可以。PDO需要依賴多種細(xì)胞在體外的自組裝形成，而腫瘤細(xì)胞系沒有自組裝的能力，可能會形成細(xì)胞團，但這并不是PDO。
Q30：PDO可以進行建庫嗎？
A30：不論是原發(fā)型還是轉(zhuǎn)移型腫瘤，都可以建立PDO樣本庫。但考慮到PDO的培養(yǎng)并不是百分之百成功的（比如CRC-PDO的培養(yǎng)成功率大約是73%【12】），因此建庫所需的樣本量會比較大。
應(yīng)用篇
類器官是能夠在體外三維培養(yǎng)，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)”。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的不斷進步，應(yīng)用也越來越廣泛。今天小編整理了一些關(guān)于類器官應(yīng)用方面的問題，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>
Q31:用于疾病研究的類器官需要最大限度減小差異。但在實際培養(yǎng)過程中，同批次類器官個體之間、以及不同批次類器官樣本之間均存在顯著差異，這個問題怎樣克服呢？
A31: 類器官是由不同類型的細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養(yǎng)條件下的孔間差異。
如果是用于患者個性化醫(yī)療的腫瘤類器官，需要更精準(zhǔn)地模擬患者體內(nèi)的特征，這種情況建議采用多個平行來減小差異；
如果是用于機制研究或用作疾病模型的類器官，可以考慮利用“微流控液滴技術(shù)”進行工程化培養(yǎng)，相關(guān)成果已發(fā)表在Cell Reports Medicine【13】。
Q32: 目前培養(yǎng)出的類器官可以進行體內(nèi)移植，用于器官重建嗎？
A32：已有動物實驗證實過可行性，比如：腸類器官移植小鼠治療潰瘍性結(jié)腸炎【14】；胰島類器官移植小鼠治療糖尿病【15】。
雖然目前類器官移植尚未進入臨床，但在2021年2月，Science【16】首次報道了利用膽道類器官修復(fù)離體條件下的人類肝臟，實現(xiàn)了膽道再生，并改善了膽汁性質(zhì)。
Q33:類器官一般長到什么程度可以用來進行藥物測試？
A33：這個問題可以在Nature Protocols【17】找到答案。
對于新鮮培養(yǎng)的類器官：建議對低代次類器官（2-3代）進行藥物篩選，以最大限度地減少使用過的培養(yǎng)基或體外突變累積對藥物測試的影響。
對于經(jīng)過凍存的類器官：由于冷凍/解凍可能導(dǎo)致復(fù)蘇時器官樣形態(tài)的變化，因此建議類器官至少傳代一次再進行藥物篩選。如果出現(xiàn)復(fù)蘇后細(xì)胞活力不佳，則需要延長培養(yǎng)時間以恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)。
Q34：類器官建立是否成功有怎樣的標(biāo)準(zhǔn)嗎？
A34：1、判斷形態(tài)。顯微鏡下類器官形態(tài)可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態(tài)一致。
2、可以鑒定相應(yīng)的biomarker是否有表達(dá)，及分布是否與組織切片相似。
3、是否能夠傳代3次以上，并可以凍存復(fù)蘇。
4、如果有條件的話，可以進行測序分析。
Q35：類器官可以進行基因編輯嗎？
A35：可以，干細(xì)胞來源類器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來源的類器官則多用于尋找疾病相關(guān)突變點或治療靶點，下圖列舉了類器官基因編輯的部分研究和應(yīng)用。
類器官基因編輯的部分研究和應(yīng)用【18】
Q36：類器官培養(yǎng)和普通細(xì)胞培養(yǎng)有何不同之處？
A36：1、細(xì)胞來源有區(qū)別：類器官的細(xì)胞來源是具有多能性的上皮細(xì)胞，而普通細(xì)胞培養(yǎng)適用于培養(yǎng)多種類型細(xì)胞；
2、 細(xì)胞培養(yǎng)方式不同：1）類器官需要基質(zhì)膠等材料支撐其三維結(jié)構(gòu)，普通細(xì)胞培養(yǎng)則不需要；2） 類器官需要實現(xiàn)體外分化和自組裝，因此需要多種細(xì)胞因子的組合進行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜。而普通細(xì)胞培養(yǎng)通常為單一種類細(xì)胞，因此培養(yǎng)基成分較簡單；
Q37：用哪種培養(yǎng)基培養(yǎng)來自轉(zhuǎn)移部位腫瘤的類器官，比如原發(fā)灶為A類型腫瘤，轉(zhuǎn)移灶為B類型腫瘤？
A37：通常來講，如果腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移，我們依然選用相對應(yīng)的原發(fā)灶（A類型）PDO培養(yǎng)基。
Q38：怎樣證明培養(yǎng)出的結(jié)構(gòu)是類器官，而不是簡單聚集在一起的細(xì)胞團？
A38：類器官的分化方式本質(zhì)上是在模擬體內(nèi)的器官發(fā)育，因此表達(dá)形態(tài)及各細(xì)胞分布情況與實際器官具有相似性，而細(xì)胞團則沒有這種規(guī)律。我們可以通過免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來區(qū)分。例如下圖中的結(jié)果表明，腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致【19】。
腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致【19】
Q39：類器官的的來源細(xì)胞必須要具有多能性嗎？正常組織成熟體細(xì)胞可以進行類器官培養(yǎng)嗎？
A39：由于類器官涉及到體外分化和自組裝，因此來源細(xì)胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細(xì)胞中往往會有一部分成體干細(xì)胞（標(biāo)志物為Lgr5，CD133等），這部分細(xì)胞也可以進行類器官培養(yǎng)。
Q40：可以通過構(gòu)建條件性培養(yǎng)基代替商品化的細(xì)胞因子嗎？
A40：依據(jù)Hans Clevers實驗室早期發(fā)表的文章，可以采用條件性培養(yǎng)基代替純化的細(xì)胞因子進行類器官培養(yǎng)，但同時也需要考慮條件性培養(yǎng)基的不足之處。小編總結(jié)了條件性培養(yǎng)基和近岸細(xì)胞因子的參數(shù)差異。
表1. 條件性培養(yǎng)基和近岸蛋白細(xì)胞因子的參數(shù)差異
總的來說，條件性培養(yǎng)基對于部分預(yù)實驗或少量類器官培養(yǎng)是可行的，但鑒于質(zhì)粒構(gòu)建和驗證消耗的時間，以及檢測過程涉及的抗體、qPCR等成本也是需要考慮在內(nèi)的。同時，細(xì)胞代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素和宿主殘留物等也有可能影響實驗結(jié)果。因此，選用高品質(zhì)的商品化細(xì)胞因子能夠幫您節(jié)約時間和金錢成本，快速推動類器官培養(yǎng)進程。
實際操作篇
類器官是能夠在體外三維培養(yǎng)，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)”。雖然許多類器官的培養(yǎng)方案日漸成熟，但在實際操作中總會碰到這樣那樣的問題，今天小編整理了一些類器官培養(yǎng)操作中常遇到的問題，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>
Q41: 按照文獻(xiàn)方法進行類器官培養(yǎng)，為什么觀察到的形態(tài)卻和文獻(xiàn)不一致？
A41:決定類器官形態(tài)的因素有很多，樣本來源是否相同、選用的細(xì)胞因子品質(zhì)是否有差異都有可能改變最終的類器官形態(tài)。這里舉一個文獻(xiàn)中的例子，分別取四個高級別漿液性（HGS）卵巢癌患者的腫瘤組織，用同樣的條件進行類器官培養(yǎng)，H&E染色結(jié)果顯示它們的形態(tài)千差萬別【20】。因此對于類器官的鑒定，我們不能局限于形態(tài)觀察，需要使用多種方法相結(jié)合。
由4例HGS卵巢癌患者的腫瘤組織所制備的類器官形態(tài)不同【20】
Q42：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？
A42：考慮到DMSO這類有機物的細(xì)胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。
Q43：培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)類器官培養(yǎng)物中有黑色小顆粒，這個是雜質(zhì)嗎？應(yīng)該怎樣去除？
A43：黑色小顆粒大概率是雜質(zhì)或細(xì)胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：
1、將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進行反復(fù)清洗，達(dá)到稀釋雜質(zhì)的作用；
2、用無菌手術(shù)刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養(yǎng)基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質(zhì)【21】。
Q44：對于腫瘤患者的個性化醫(yī)療測試，PDO、PDX、PDXO的模型可以相互結(jié)合使用嗎？
A44：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優(yōu)勢，通常有以下兩種結(jié)合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。
1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。
2、PDX-PDXO是更精準(zhǔn)的藥物測試方式，即：先利用PDX產(chǎn)生大量的體內(nèi)腫瘤，然后將這些腫瘤分離進行PDXO培養(yǎng)，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結(jié)果與體內(nèi)用藥結(jié)果一一對應(yīng)，進而預(yù)測人體用藥的結(jié)果，實現(xiàn)對患者更精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)；并且可以用PDX模型將轉(zhuǎn)移后的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養(yǎng)和用藥，能夠更精確地對轉(zhuǎn)移灶進行藥物篩選。
Q45：類器官怎么從基質(zhì)膠中回收？
A45：1、將類器官放置在冰上，待基質(zhì)膠融化后離心進行回收，這種方式適用于不需要將類器官結(jié)構(gòu)完全打散的情況；
2、市售的細(xì)胞回收液，可以溫和有效地獲得細(xì)胞懸液，不會損傷細(xì)胞或細(xì)胞表面蛋白。
Q46：為什么用基質(zhì)膠來培養(yǎng)類器官？可以用其它類型的凝膠替代嗎？
A46：基質(zhì)膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養(yǎng)用的基質(zhì)膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質(zhì)，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質(zhì)。由于基質(zhì)膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質(zhì)膠替代方案的研究，見下圖【22】。
基質(zhì)膠的三種替代方案【22】。（a）去細(xì)胞外基質(zhì)和其他衍生蛋白質(zhì)，（b）合成水凝膠，以及（c）工程重組蛋白凝膠
Q47：怎樣確定某一種類器官的培養(yǎng)方式更適用于基質(zhì)膠包埋法還是氣-液交互法呢？
A47：1、根據(jù)所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養(yǎng)傾向于利用氣-液交互法來培養(yǎng)【23】；
2、考慮所培養(yǎng)的類器官模型的應(yīng)用方向，例如：氣-液交互法培養(yǎng)易于進行病毒感染實驗，因此用于病毒感染實驗的氣道類器官會優(yōu)先選擇氣-液交互法培養(yǎng)【24】。
Q48：在進行藥敏實驗前，類器官的接種方式是怎樣的呢？
A48：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質(zhì)膠的培養(yǎng)基懸浮，并最終鋪在基質(zhì)膠包被的孔板中【25-26】。
Q49：在離心回收時，會有很多類器官粘附在離心管壁，有沒有更好的辦法提高回收率？
A49：建議采用水平轉(zhuǎn)子代替角轉(zhuǎn)子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。
Q50：利用腫瘤類器官模型進行篩選的藥物有什么局限性嗎？
A50：1、抗體藥物因為需要免疫細(xì)胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構(gòu)建腫瘤類器官-腫瘤微環(huán)境的模型來實現(xiàn)；
2、由于腫瘤類器官中沒有對血管進行培養(yǎng)，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。
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