肌肉是人體的重要組成部分，不僅是多種肌營養不良疾病基因治療的靶組織，還可作為生產和分泌治療遠端器官疾病功能蛋白的生物工廠，肌肉組織的這些特征使其成為開發基因治療策略的通用平臺，用于遞送相關疾病功能基因。AAV載體是將基因轉移到骨骼肌和心肌等肌肉組織的理想載體，經AAV轉導后肌肉細胞可以表達功能性重組蛋白，并將這些蛋白分泌到血液中進行全身遞送，通過這種策略用于糖尿病、動脈粥樣硬化、血友病及癌癥等的疾病治療，目前由AAV介導的肌肉基因治療已逐步邁入臨床。本期我們整理了AAV在肌肉組織的靶向策略以及部分案例，希望對大家的研究有所幫助。
01啟動子的選擇
在肌肉組織的研究中，除了可以選擇CMV和CAG等常用的廣譜啟動子，還可選擇肌肉特異性啟動子MCK，以實現基因在肌肉中高效和特異性的表達。
維真生物肌肉組織特異性啟動子可供選擇：
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名稱 |
大小 |
來源 |
描述 |
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MCK |
1.3 kb |
小鼠 |
肌酸激酶基因啟動子 |
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3×enhancer |
728 bp |
小鼠 |
修改的肌酸激酶基因啟動子 |
02 AAV血清型的選擇
根據文獻報道，AAV1、2、6、7、8和9均可有效轉導肌肉組織，但若要實現基因在肌肉組織的更高特異性地表達，通常是建議結合合適的血清型、肌肉特異性啟動子以及適當的給藥方式來實現。
- AAV9結合CK6啟動子，通過頸靜脈注射的方式可高效、選擇性的將基因傳遞到骨骼肌。
AAV9結合CK6啟動子經頸靜脈注射后高效靶向缺血性骨骼肌
（Katwal AB, et al. Gene Ther. 2013）
- AAV1和AAV6均可有效靶向橫紋肌，由于AAV6與肝素有較好的親和力，與AAV1相比，無論是通過肌肉注射還是靜脈注射，AAV6都能以更高的效率持續轉導橫紋肌。
相比AAV1，AAV6經肌肉注射后有效靶向橫紋肌
相比AAV1，AAV6經靜脈注射后有效靶向橫紋肌
- 來自美國布羅德研究所和哈佛大學等研究機構的研究人員在小鼠和靈長類動物體內定向進化出一種工程化改造的AAV載體— MyoAAV，研究顯示這種載體能夠高效靶向肌肉組織，遞送到肌肉組織的效率是傳統病毒載體的10倍以上。同時，與傳統遞送載體相比，該載體在遺傳性肌肉疾病中的治療劑量降低大約100到250倍，可有效降低肝臟損傷和其他嚴重副作用的風險。
全身給藥后，MyoAAV 1A可高效轉導小鼠骨骼肌
03 AAV給藥途徑的選擇
載體給藥途徑可以影響AAV在體內的組織趨向性和轉導效率。多種AAV給藥途徑可以實現局部或全身的肌肉基因轉移，以達到不同的治療目的，如肌肉注射、逆行經靜脈肢體灌注、冠狀動脈內灌注、再循環給藥、腹腔注射和靜脈給藥，以及針對特定器官的方法比如心包內注射和心內膜注射等。
其中，肌肉注射簡單方便，可以將載體輸送到目標肌肉群，小鼠肌肉注射的常見部位包括脛骨前肌、腓腸肌和股四頭??；逆行經靜脈肢體灌注針對更多的肌肉群，更加適合治療影響大肌肉群的疾病；心包內注射通常用于新生動物，可同時轉導心臟和隔膜；心內膜注射在犬和NHP模型中可實現心臟基因的整體遞送；冠狀動脈內灌注將治療基因傳遞到心臟已應用于臨床試驗；腹腔注射和靜脈給藥可實現全身的肌肉基因轉移，但易產生脫靶和免疫毒性。
下面簡述肌肉注射方式的操作步驟：
1. 對小鼠進行稱重，腹腔注射甲苯噻嗪/氯胺酮混合液將小鼠麻醉；
2. 對小鼠右脛前肌進行刮毛及消毒處理；
3. 使用適當大小的注射器及針頭，以避免觸碰到坐骨神經的方式入針，將病毒載體注入右脛前肌；
4. 將針頭緩慢抽出，輕輕施加壓力以防止回流；
5. 將小鼠放在加熱墊上直至恢復，然后放回籠中飼養觀察，注射病毒4周后可檢測轉基因的表達。
小鼠肌肉注射示意圖
（https://www.theodora.com/rodent_laboratory/injections.html）
04 不同注射方式的AAV給藥劑量
