骨關(guān)節(jié)炎（OA）是常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，影響著全球數(shù)億人口。軟骨鈣化是骨關(guān)節(jié)炎的核心病理特征，磷酸鈣結(jié)晶在病變關(guān)節(jié)中的沉積與關(guān)節(jié)破壞程度正相關(guān)，且鈣化并非骨關(guān)節(jié)炎的繼發(fā)產(chǎn)物，而是驅(qū)動疾病進(jìn)展的始動因素。了解病理性軟骨鈣化的機(jī)制對于制定有效的策略來遏制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展至關(guān)重要。
空軍軍醫(yī)大學(xué)牛麗娜、焦凱教授團(tuán)隊(duì)在Science Bulletin（IF 21.1）上發(fā)表了題為“Mitochondria serve as a source of mineral precursors initiating early cartilage calcification in osteoarthritis”的文章，研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎的病理性軟骨鈣化中，礦物前體起源于線粒體，闡明了線粒體介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨鈣化的分子機(jī)制，為早期干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎提供了全新的治療靶點(diǎn)。
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In vivo
基因信息 ChCHD6：卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白6
病毒產(chǎn)品 AAV2-COL2A1-Chchd6OE-GFP（1.14×1013 vg/mL），AAV2-COL2A1-GFP（6.97×1013 vg/mL）
實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6J 小鼠
注射部位及體積 顳下頜關(guān)節(jié)腔：300nL；膝關(guān)節(jié)腔：500nL
In vitro
病毒產(chǎn)品 Lv-CHCHD6，Lv-PHB2，Lv-control
感染細(xì)胞 軟骨細(xì)胞
感染用量 200pfu/1cell
01部分研究結(jié)果
1、線粒體內(nèi)顆粒在軟骨鈣化中的作用
首先，研究人員在C57BL/6J小鼠的顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)和膝關(guān)節(jié)誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，組織學(xué)檢查證實(shí)了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，小鼠軟骨內(nèi)出現(xiàn)病理性鈣化。骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)一周后，未染色的電子顯微鏡檢查顯示線粒體基質(zhì)內(nèi)有高電子密度顆粒，元素分析證實(shí)該顆粒鈣、磷含量較高，顆粒直徑明顯大于對照組。對線粒體中富含礦物質(zhì)的顆粒的鑒定表明，其可能是骨關(guān)節(jié)炎軟骨鈣化的礦物質(zhì)來源。進(jìn)一步用透射電子顯微鏡觀察了高電子密度顆粒在不同樣品中的分布，發(fā)現(xiàn)線粒體衍生的礦物質(zhì)可能通過基于囊泡的運(yùn)輸參與軟骨鈣化。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在骨關(guān)節(jié)炎條件下有更多線粒體衍生的富鈣小泡，將該囊泡與膠原共培養(yǎng)可誘導(dǎo)明顯礦化，而非線粒體來源的富鈣囊泡礦化能力弱，對照組無礦化。表明與病理性軟骨鈣化相關(guān)的囊泡中的礦物質(zhì)來自線粒體，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了該現(xiàn)象；以上結(jié)果表明線粒體內(nèi)顆粒是軟骨鈣化的礦物質(zhì)前體。
圖1. 線粒體內(nèi)顆粒是早期軟骨鈣化的礦物質(zhì)來源
2、線粒體 DNA（mtDNA）參與線粒體內(nèi)礦化前體的形成
已有研究表明DNA可以促進(jìn)病理性鈣化及其與線粒體的密切聯(lián)系，假設(shè)mtDNA可能作為線粒體內(nèi)病理性礦化的中介。利用QPCR檢測早期骨性關(guān)節(jié)炎模型軟骨細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)，誘導(dǎo)OA后1周，mtDNA 拷貝數(shù)無顯著變化，中晚期（3/6 周）拷貝數(shù)下降，可能是因細(xì)胞應(yīng)激線粒體生物發(fā)生產(chǎn)生影響。隨著骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，茜素紅評估的鈣化明顯加強(qiáng)。值得注意的是，新出現(xiàn)的鈣化區(qū)域主要位于線粒體DNA附近或與線粒體DNA共同定位。這種時(shí)空相關(guān)性強(qiáng)烈地表明，線粒體DNA空間積聚是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過程中先于并可能協(xié)調(diào)隨后的病理性鈣化過程的早期事件。免疫熒光和CRISPR-dCas9活細(xì)胞熒光原位雜交證實(shí)，早期骨關(guān)節(jié)炎中mtDNA與鈣在線粒體中共定位，且共定位水平顯著高于對照組；鈣和mtDNA還會從線粒體協(xié)同釋放至胞質(zhì)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的結(jié)合。表明了mtDNA與鈣在軟骨細(xì)胞中的共存，提示mtDNA可能在骨關(guān)節(jié)炎條件下礦物前體的形成中發(fā)揮作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)mtDNA可穩(wěn)定鈣磷，形成無定形礦化前體；mtDNA 耗竭會破壞礦化前體的形成，無法誘導(dǎo)病理性鈣化。
圖2. 線粒體DNA介導(dǎo)的鈣和磷對礦物前體形成的穩(wěn)定作用
3、CHCHD6 缺失是導(dǎo)致mtDNA異常聚集的核心原因
在骨關(guān)節(jié)炎條件下，線粒體內(nèi)mtDNA分子發(fā)生聚集，轉(zhuǎn)變?yōu)橄嗷ミB接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究人員將不同空間特征的mtDNA與飽和濃度的鈣和磷混合進(jìn)行體外測試，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎條件下提取的mtDNA能夠穩(wěn)定鈣和磷、形成無定形的功能性礦化前體，而對照組的mtDNA 與鈣磷結(jié)合后形成無功能的針狀聚集體。通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異表達(dá)蛋白，并結(jié)合文獻(xiàn)篩選出4個(gè)與mtDNA分布相關(guān)的候選蛋白，對其進(jìn)行上調(diào)/下調(diào)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，僅 CHCHD6的上調(diào)能顯著減少體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的病理性鈣化。CHCHD6是線粒體內(nèi)膜復(fù)合體的組成成分，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與MICOS復(fù)合物的CHCHD3、mitofilin存在相互作用，可通過調(diào)控線粒體嵴的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來影響mtDNA的空間分布。實(shí)驗(yàn)表明，CHCHD6 的缺失會導(dǎo)致線粒體嵴的結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)而引發(fā)mtDNA分子的異常聚集；而上調(diào)CHCHD6 則能逆轉(zhuǎn)mtDNA的聚集，減少礦化前體形成。利用AAV在體內(nèi)靶向上調(diào)軟骨細(xì)胞中 CHCHD6的表達(dá)，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)軟骨的病理性鈣化顯著減少，證實(shí)與對照組相比，CHCHD6 的上調(diào)能更好地減弱骨關(guān)節(jié)炎的病理性鈣化。研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了包被線粒體靶向肽 SS31、可靶向線粒體的負(fù)載CHCHD6脂質(zhì)體，將其混合到ROS響應(yīng)性可注射 HAMA/PBA-HA水凝膠中，通過微流控技術(shù)制成水凝膠微球；該微球可將CHCHD6高效遞送至軟骨細(xì)胞的線粒體，且不會顯著增加細(xì)胞死亡率，有效避免了全身性過表達(dá) CHCHD6帶來的潛在副作用。
圖3. 線粒體靶向CHCHD6的微球阻止礦物質(zhì)前體的形成，并阻礙骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展
02結(jié)論
本研究表明當(dāng)線粒體DNA聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，礦物前體來自軟骨細(xì)胞的線粒體，解決了與早期軟骨鈣化相關(guān)的一個(gè)重大知識缺口。通過闡明這些機(jī)制，有助于更全面地了解軟骨鈣化的早期發(fā)病機(jī)制，確定潛在的治療干預(yù)目標(biāo)，以防止或減緩病理性鈣化。