研究背景
鈣化性主動脈瓣疾病（CAVD）是全球范圍內常見的人類瓣膜疾病，目前缺乏有效的藥理學方法。核受體亞家族4A組成員1(NR4A1)與多種心血管疾病的發病機制密切相關，已成為診斷和治療多種疾病的關鍵靶點。然而，NR4A1在CAVD發病中的具體分子機制和功能意義尚未全面闡明。華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院（武漢協和醫院）董念國、史嘉瑋研究團隊在International Journal of Biological Sciences (IF 10)上發表文章“Orphan Nuclear Receptor NR4A1 Promotes Proliferation and Osteogenic Differentiation of Valvular Interstitial Cells through Activation of CCND2”，證明NR4A1顯著促進細胞增殖并強化VIC的成骨分化過程，提出靶向NR4A1可能是CAVD的潛在治療策略。
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基因信息 NR4A1：核受體亞家族4A組成員1
病毒產品 Ad-NR4A1
實驗細胞 原代瓣膜間質細胞（VICs）
MOI 70
結果展示
1. NR4A1促進VICs的成骨分化
作者發現人鈣化主動脈瓣(CAV)中NR4A1顯著上調，因此探討了NR4A1對VICs的成骨分化的影響。發現NR4A1表達在成骨誘導過程中增加，同時成骨標記物RUNX2和ALP上調，表明其參與原代瓣膜間質細胞（VICs）分化。作者通過siNR4A1或腺病毒（Ad-NR4A1）以沉默或過表達NR4A1。蛋白質印跡分析顯示，沉默NR4A1會降低ALP和RUNX2的表達，而過表達會增強其水平。同樣沉默NR4A1后，ALP和鈣鹽沉積的活性顯著降低，而過表達導致相反的結果。此外，通過NR4A1激動劑Csn-B和抑制劑DIM-C干預，發現NR4A1的激活促進VIC增殖并加劇主動脈瓣鈣化。
圖1 NR4A1促進VIC成骨分化
2. NR4A1通過上調CCND2促進VIC增殖和鈣化
作者通過轉錄組分析篩選了成骨分化至關重要的NR4A1候選靶基因，發現NR4A1可能通過調控CCND2來調節VIC的細胞周期，并證實了CCND2在瓣膜鈣化過程中發揮重要功能。然后作者進行了挽救實驗，以確定NR4A1是否通過上調CCND2來發揮其作用。免疫印跡顯示CCND2敲除有效減弱NR4A1誘導的RUNX2和ALP上調。此外，CCND2缺失抑制了NR4A1過表達引發的細胞增殖。CCND2敲除降低了ALP活性和鈣沉積，相反，CCND2的過表達逆轉了NR4A1敲低誘導的鈣化效應。這些結果表明NR4A1通過上調人VIC中的CCND2促進細胞增殖并加速細胞成骨轉化。
圖2 CCND2沉默可減輕NR4A1誘導的成骨分化表型
3. 抑制NR4A1可減輕體內主動脈瓣鈣化
作者進一步在體內探究NR4A1抑制對主動脈瓣鈣化的影響。ApoE−/−小鼠均接受24周的高脂肪飲食，其中一組接受DIM-C（NR4A1抑制劑）治療，另一組不接受DIM-C。超聲心動圖評估顯示，與未經DIM-C治療組相比，DIM-C治療組中的小鼠表現出最大跨瓣膜射流速度和平均跨瓣膜壓力梯度顯著降低。此外DIM-C治療引起ApoE−/−小鼠主動脈瓣增厚顯著減弱，主動脈瓣葉內的鈣沉積明顯減少，膠原蛋白形成減少。成骨標志物RUNX2的免疫熒光染色顯示，DIM-C治療組中RUNX2表達顯著下調。作者進一步評估了DIM-C的潛在副作用，發現DIM-C治療組與對照組之間與肝腎功能相關的生化參數沒有顯著差異。HE染色顯示DIM-C對心臟、肝臟、脾臟、肺或腎臟沒有顯著影響，這些體內結果強調，抑制NR4A1可以有效減輕主動脈瓣鈣化。
圖3 體內抑制NR4A1可減輕主動脈瓣鈣化
實驗結論
本研究研究揭示了CAVD中NR4A1的顯著上調，證明NR4A1通過上調細胞周期相關蛋白CCND2的表達在VIC的增殖和細胞外基質合成中發揮關鍵作用，表明靶向NR4A1或CCND2可能成為治療CAVD的創新方法。