期刊：EBioMedicine
影響因子: 11.1
主要技術(shù)：ScRNA-seq
導(dǎo)語
膽囊癌(GBC)是膽道最常見的惡性腫瘤，診斷晚，生存率低，需要不斷尋找新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERVs)在多種癌癥中特別容易被重新激活，并與癌癥進(jìn)展和免疫治療有關(guān)。
方法
對4例GBC患者的腫瘤組織及配對癌旁組織進(jìn)行scRNA-seq。采用雙熒光素酶報告試驗測定HERV序列增強子活性。
發(fā)現(xiàn)
剖析了GBC的細(xì)胞多樣性并描述了HERV轉(zhuǎn)錄組景觀。發(fā)現(xiàn)HERV以細(xì)胞類型特異性的方式轉(zhuǎn)錄，不同的HERV家族與不同的生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)。HERV可能起增強子的作用，可能導(dǎo)致鄰近基因的表達(dá)改變。
隨著上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，HERVH的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，提示HERVH可能是GBC早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。HHLA2是一種新興的免疫檢查點，由HERVH衍生而來，與HERVH表現(xiàn)出表達(dá)相關(guān)性，被認(rèn)為是一種有前景的免疫治療靶點。
研究技術(shù)
ScRNA-seq
研究結(jié)果
1. GBC中HERV的異常激活
為了研究GBC的細(xì)胞異質(zhì)性和表征其分子特征，收集了4例GBC患者的腫瘤組織和匹配的正常組織進(jìn)行scRNA-seq。經(jīng)過qc過濾后，共獲得28301個細(xì)胞，分為11種細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK或NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。T細(xì)胞和上皮細(xì)胞是腫瘤和鄰近正常組織中最豐富的細(xì)胞。上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞主要富集于腫瘤組織中。
對GBC患者的HERV表達(dá)模式進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)來自GBC組織的樣本比來自鄰近正常組織的樣本具有更活躍的HERV位點和更高的HERV表達(dá)水平。腫瘤組織中HERVs的抑制意味著HERVs可能在GBC的起始和進(jìn)展中發(fā)揮作用。此外，僅基于HERV表達(dá)的降維分析顯示，具有相同細(xì)胞標(biāo)簽的細(xì)胞傾向于聚集在一起，這表明HERVs在腫瘤中以細(xì)胞類型特異性的方式積極轉(zhuǎn)錄。計算了每種細(xì)胞類型中所有HERV家族和HERV位點的差異表達(dá)，在癌癥研究中，HERVE、HERVK和HERVH等家族主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)。
Fig 1. GBC及鄰近正常組織的單細(xì)胞景觀和HERV表達(dá)模式
2. HERVs作為增強子可能調(diào)節(jié)鄰近的DEGs
對于除NK/NKT細(xì)胞外的所有細(xì)胞類型，與鄰近正常組織相比，HERVs在腫瘤中被廣泛激活，而HERVs在上皮細(xì)胞中表達(dá)水平最高。與來自鄰近正常組織的T細(xì)胞中只有4個HERV位點顯著增加，而GBC衍生的樹突狀細(xì)胞中只有5個HERV位點顯著增加。對于每一種細(xì)胞類型，由HERVs位點顯著升高引起的增量只占所有HERVs引起的總增量的一小部分，這表明研究人員也應(yīng)該考慮未通過截止點的HERV位點。這也提醒要在位點水平和家族水平上探索HERV在GBC中的異常表達(dá)。
HERV作為影響宿主基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件已被許多研究證實。為了找到作為增強子驅(qū)動鄰近DEGs表達(dá)的HERVs，使用上皮細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合其他信息數(shù)據(jù)來預(yù)測可能的聯(lián)系挑出了這一對在來自GBC的上皮細(xì)胞中，HERV位點和鄰近的DEGs均上調(diào)。然后，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的過濾：1)HERV和鄰近的DEG在GBC來源的上皮細(xì)胞中共表達(dá)；2)通過基因?qū)W家數(shù)據(jù)庫預(yù)定義的增強基因連接，預(yù)測調(diào)控元件之間的關(guān)聯(lián)增強子和啟動子）和基于多個信息源的靶基因；3) HERV區(qū)域顯示增強子樣簽名，支持高DNase和H3K27ac和低H3K4me3信號。只要HERVs和相鄰的DEGs符合上述任何兩個標(biāo)準(zhǔn)，HERVs被認(rèn)為是建模相鄰DEGs表達(dá)的候選增強子。
選擇了一些預(yù)測的HERVs，通過雙熒光素酶報告基因分析來驗證來自HERVs的基因組片段具有增強子活性。鄰近基因，如UCA1、SEPHS2和DCTPP1，可能受HERV衍生增強子調(diào)控，已被報道在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌作用。
Fig 2. HERV衍生增強子預(yù)測
3. HERVH在上皮細(xì)胞中的表達(dá)隨著上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化而增加
為了區(qū)分GBC組織中的惡性上皮細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞，以基質(zhì)細(xì)胞為參考，推斷了大規(guī)模的CNVs。將上皮細(xì)胞分亞群，CNV評分明顯較高的亞群被鑒定為惡性細(xì)胞。在惡性轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄軌跡中，中期的Epi_EDN1（高）細(xì)胞和早期的Epi_EDN1（低）細(xì)胞證實了這些假設(shè)。腫瘤及鄰近正常組織在不同的部位包含所有亞型。惡性細(xì)胞主要在腫瘤中被識別出來，而Epi_EDN1（低）細(xì)胞在鄰近的正常組織中更為富集。
惡性細(xì)胞的HERVs表達(dá)水平最高。為了進(jìn)一步探索HERVH的異常激活，構(gòu)建了一個明確的惡性和非惡性上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄軌跡。在隨著腫瘤進(jìn)展而顯示轉(zhuǎn)錄改變的HERVs中，HERVH家族的HERVH-int、LTR7Y和LTR7的意義最高，提示HERVH可能是一種早期GBC診斷的生物標(biāo)志物。鑒定了在惡性細(xì)胞中與這些HERVH元件表達(dá)相關(guān)的基因。這些基因在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、粒細(xì)胞趨化性、細(xì)胞增殖和分化相關(guān)方面高度富集。這些基因表達(dá)的改變可能是由HERVH的抑制引起的
HERVs在免疫治療中被高度重視，如免疫檢查點抑制劑，因為它們能夠使腫瘤細(xì)胞對免疫識別敏感。HHLA2是一種最近出現(xiàn)的免疫檢查點，被認(rèn)為是由HERVH衍生出來的。HHLA2被認(rèn)為在致癌過程中起雙重作用：一種用于免疫刺激，另一種用于免疫抑制。檢測了上皮細(xì)胞亞型中HHLA2的轉(zhuǎn)錄，以及腫瘤細(xì)胞中可能表達(dá)的一些免疫檢查點。HHLA2在Epi_EDN1（高）（代表ICS）和惡性細(xì)胞中均有表達(dá)，且高于PD-L1（CD274），這是研究最多的免疫檢查點。PD-L1轉(zhuǎn)錄的弱信號可能至少部分解釋了針對PD-L1的免疫治療在一些GBC患者中的有限療效有限。HHLA2在中間細(xì)胞和惡性細(xì)胞中表達(dá)水平的升高及其在癌變中的雙重作用（一種免疫刺激，另一種免疫抑制）提示HHLA2可能是GBC治療的良好候選藥物。此外，我們發(fā)現(xiàn)了HHLA2和HERVH元件的表達(dá)相關(guān)性，這意味著將旨在誘導(dǎo)HERVH激活的DNA去甲基化劑與靶向HHLA2治療相結(jié)合可能是一種很有前途的治療策略。
Fig 3. 惡性轉(zhuǎn)化過程中惡性細(xì)胞的鑒定及HERVH的抑制
4. 增殖T細(xì)胞顯示出異常高的HERV表達(dá)
T細(xì)胞在TME中表現(xiàn)出細(xì)胞組成和功能狀態(tài)的異質(zhì)性。T細(xì)胞被進(jìn)一步劃分為7個不同的亞群。與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中naïve CD4+ T和CD4−/CD8−T細(xì)胞比例減少，增殖T和調(diào)節(jié)性/耗盡的CD4+ T細(xì)胞比例增加。更多的調(diào)節(jié)性/耗盡的CD4+ T細(xì)胞在腫瘤組織中積累，表明在腫瘤進(jìn)展過程中從免疫激活到免疫抑制的變化。
HERVs在不同亞型的T細(xì)胞中均有不同水平的表達(dá)。將來自腫瘤組織的細(xì)胞與來自鄰近正常組織的細(xì)胞進(jìn)行比較時，除初始CD4+ T和CD4+ Th細(xì)胞外，所有T細(xì)胞亞型中均觀察到顯著的HERV轉(zhuǎn)錄變化。HERVH相關(guān)元件、LTR13A、MER41B、LTR12C和MLT1D在來自腫瘤組織的增殖T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。與HERVH上調(diào)相關(guān)相關(guān)基因與T細(xì)胞活化相關(guān)。
此外，在腫瘤組織中也檢測到HERVH在調(diào)節(jié)/耗盡CD4+ T細(xì)胞中高表達(dá)，在CD8+ T GZMB和LTR7Y和CT在CD4−/CD8−T細(xì)胞中高表達(dá)。
Fig 4. 增殖性T細(xì)胞顯示HERVs的顯著表達(dá)水平
5. 血漿B細(xì)胞中IgG基因與MLT1C位點的關(guān)聯(lián)
浸潤TME的B細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤免疫中發(fā)揮著多方面的作用。B細(xì)胞亞型鑒定出三種主要的細(xì)胞亞群。這些B細(xì)胞亞群的組成在GBC和正常樣本之間是不同的。在GBC中，漿細(xì)胞的相對比例增加，而濾泡B細(xì)胞在正常樣本中富集，并在鄰近正常組織中占B細(xì)胞的大部分。直接比較各B細(xì)胞亞型在GBC和正常組織中HERVs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的濾泡B細(xì)胞和血漿B細(xì)胞表現(xiàn)出HERV轉(zhuǎn)錄豐度的增加。與非腫瘤來源的濾泡B細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中HERVH-int和MSTC的表達(dá)水平更高。漿B細(xì)胞是終末分化的B細(xì)胞，可以分泌抗體，是其重要組成部分。發(fā)現(xiàn)了一個MLT1C位點與鄰近的IgG基之間的轉(zhuǎn)錄關(guān)。這兩種基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)和上調(diào)可以推測MLT1C-dup586-chr14可能是促進(jìn)這些鄰近IgG基因表達(dá)的調(diào)控因子。
Fig 5. IgG基因與血漿B細(xì)胞中鄰近的MLT1C位點相關(guān)
6. HERVH在所有髓系細(xì)胞類型中的過表達(dá)
髓系細(xì)胞被分為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。根據(jù)突出的表達(dá)標(biāo)記物進(jìn)一步分為常規(guī)DC（cDC1和cDC2）、單核細(xì)胞來源的DC（mo-DC）和成熟DC。對于腫瘤和鄰近組織，cDC2和mo-DC占樹突狀細(xì)胞的大多數(shù)，mo-DC和成熟的DC在GBC組織中富集，而cDC1s和cDC2s則被耗盡。不同DC亞型間的HERV表達(dá)模式有所不同。GBC中cdc1和mo-樹突狀細(xì)胞HERV的表達(dá)顯著升高，而cdc2和成熟樹突狀細(xì)胞的表達(dá)無顯著差異。Mo-DCs被認(rèn)為是來自于炎癥或感染背景下的單核細(xì)胞，該亞群可以在各種腫瘤模型中誘導(dǎo)T細(xì)胞激活。LTR7Y在來自GBC組織的mo-DCs中過表達(dá)。在mo-DCs中與LTR7Y表達(dá)模式相似的基因主要與抗病毒應(yīng)答和T細(xì)胞活化有關(guān)，提示mo-DCs抗病毒和炎癥能力的增強可能受到LTR7Y的調(diào)控。
此外，LTR7Y與MMP7基因表現(xiàn)出很強的相關(guān)性，MMP7作為一種致癌因子介導(dǎo)幾種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。這種關(guān)聯(lián)也在惡性細(xì)胞、增殖T細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中可見。在其他髓系細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中也觀察到HERVH元素的表達(dá)顯著增加。綜上所述，HERVH元素在幾乎所有的髓系細(xì)胞類型中都表達(dá)上調(diào)，它們可能對髓系細(xì)胞的行為和功能有類似的影響。
Fig.6 髓系細(xì)胞中HERVH的活化
7. MER65-int在成纖維細(xì)胞中被激活，并與ECM基因有表達(dá)相關(guān)性
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤間質(zhì)中最主要的組成部分之一，具有異質(zhì)性的表型和功能。成纖維細(xì)胞分成了2種主要不同的亞型，包括炎癥性CAFs（iCAFs；FDGFRA）和肌癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（myoCAFs；RGS5）。在GBC組織和鄰近正常組織中，iCAFs是主要的細(xì)胞類型。與正常組織相比，GBC組織中myoCAFs的比例增加，而iCAFs的水平略有下降。在HERV的表達(dá)水平方面，腫瘤中iCAFs和myoCAFs均顯著升高。篩選了GBC中異常激活的HERV。對于iCAFs，MER65-int、MER4D0和MER4- int是上調(diào)最多的HERV。在位點水平上，MER65-int-dup5-chr19在iCAFs中與其鄰近基因CEACAM5相關(guān)。CEACAM5編碼癌胚抗原（CEA），已被用作臨床檢測的腫瘤生物標(biāo)志物。在GBC-來源的巨噬細(xì)胞中也觀察到了這種關(guān)。對于myoCAFs，在GBC來源的細(xì)胞中特異性激活的MER65-int顯示出與ECM組織相關(guān)的基因的相關(guān)性。這表明活躍的MER65-int可能參與了ECM基因的失調(diào)。在來自GBC組織的內(nèi)皮細(xì)胞中，MER50、LTR7C、LTR6A和MLT1A0表達(dá)上調(diào)。然而，這些HERV家族如何影響細(xì)胞功能尚不清楚。
Fig 7. MER65-int在成纖維細(xì)胞中的活化
參考文獻(xiàn)：
Wang J, Ren M, Yu J, Hu M, Wang X, Ma W, Jiang X, Cui J. Single-cell RNA sequencing highlights the functional role of human endogenous retroviruses in gallbladder cancer. EBioMedicine. 2022 Nov;85:104319. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104319IF: 11.1 Q1 . Epub 2022 Oct 29. PMID: 36374772IF: 11.1 Q1 ; PMCID: PMC9626538IF: 11.1 Q1 .