期刊：EBioMedicine
影響因子: 11.1
主要技術：ScRNA-seq
導語
膽囊癌(GBC)是膽道最常見的惡性腫瘤，診斷晚，生存率低，需要不斷尋找新的診斷生物標志物和治療靶點。人類內源性逆轉錄病毒(HERVs)在多種癌癥中特別容易被重新激活，并與癌癥進展和免疫治療有關。
方法
對4例GBC患者的腫瘤組織及配對癌旁組織進行scRNA-seq。采用雙熒光素酶報告試驗測定HERV序列增強子活性。
發現
剖析了GBC的細胞多樣性并描述了HERV轉錄組景觀。發現HERV以細胞類型特異性的方式轉錄，不同的HERV家族與不同的生物學效應相關。HERV可能起增強子的作用，可能導致鄰近基因的表達改變。
隨著上皮細胞的惡性轉化，HERVH的轉錄水平逐漸升高，提示HERVH可能是GBC早期診斷的潛在生物標志物。HHLA2是一種新興的免疫檢查點，由HERVH衍生而來，與HERVH表現出表達相關性，被認為是一種有前景的免疫治療靶點。
研究技術
ScRNA-seq
研究結果
1. GBC中HERV的異常激活
為了研究GBC的細胞異質性和表征其分子特征，收集了4例GBC患者的腫瘤組織和匹配的正常組織進行scRNA-seq。經過qc過濾后，共獲得28301個細胞，分為11種細胞類型，包括上皮細胞、B細胞、T細胞、NK或NKT細胞、單核細胞、巨噬細胞、DCs、中性粒細胞、肥大細胞、成纖維細胞和內皮細胞。T細胞和上皮細胞是腫瘤和鄰近正常組織中最豐富的細胞。上皮細胞、單核細胞和巨噬細胞主要富集于腫瘤組織中。
對GBC患者的HERV表達模式進行了表征，發現來自GBC組織的樣本比來自鄰近正常組織的樣本具有更活躍的HERV位點和更高的HERV表達水平。腫瘤組織中HERVs的抑制意味著HERVs可能在GBC的起始和進展中發揮作用。此外，僅基于HERV表達的降維分析顯示，具有相同細胞標簽的細胞傾向于聚集在一起，這表明HERVs在腫瘤中以細胞類型特異性的方式積極轉錄。計算了每種細胞類型中所有HERV家族和HERV位點的差異表達，在癌癥研究中，HERVE、HERVK和HERVH等家族主要在上皮細胞中表達。
Fig 1. GBC及鄰近正常組織的單細胞景觀和HERV表達模式
2. HERVs作為增強子可能調節鄰近的DEGs
對于除NK/NKT細胞外的所有細胞類型，與鄰近正常組織相比，HERVs在腫瘤中被廣泛激活，而HERVs在上皮細胞中表達水平最高。與來自鄰近正常組織的T細胞中只有4個HERV位點顯著增加，而GBC衍生的樹突狀細胞中只有5個HERV位點顯著增加。對于每一種細胞類型，由HERVs位點顯著升高引起的增量只占所有HERVs引起的總增量的一小部分，這表明研究人員也應該考慮未通過截止點的HERV位點。這也提醒要在位點水平和家族水平上探索HERV在GBC中的異常表達。
HERV作為影響宿主基因轉錄的調控元件已被許多研究證實。為了找到作為增強子驅動鄰近DEGs表達的HERVs，使用上皮細胞的scRNA-seq數據結合其他信息數據來預測可能的聯系挑出了這一對在來自GBC的上皮細胞中，HERV位點和鄰近的DEGs均上調。然后，根據以下標準進行進一步的過濾：1)HERV和鄰近的DEG在GBC來源的上皮細胞中共表達；2)通過基因學家數據庫預定義的增強基因連接，預測調控元件之間的關聯增強子和啟動子）和基于多個信息源的靶基因；3) HERV區域顯示增強子樣簽名，支持高DNase和H3K27ac和低H3K4me3信號。只要HERVs和相鄰的DEGs符合上述任何兩個標準，HERVs被認為是建模相鄰DEGs表達的候選增強子。
選擇了一些預測的HERVs，通過雙熒光素酶報告基因分析來驗證來自HERVs的基因組片段具有增強子活性。鄰近基因，如UCA1、SEPHS2和DCTPP1，可能受HERV衍生增強子調控，已被報道在腫瘤增殖和轉移中發揮致癌作用。
Fig 2. HERV衍生增強子預測
3. HERVH在上皮細胞中的表達隨著上皮細胞的惡性轉化而增加
為了區分GBC組織中的惡性上皮細胞和正常上皮細胞，以基質細胞為參考，推斷了大規模的CNVs。將上皮細胞分亞群，CNV評分明顯較高的亞群被鑒定為惡性細胞。在惡性轉化的轉錄軌跡中，中期的Epi_EDN1（高）細胞和早期的Epi_EDN1（低）細胞證實了這些假設。腫瘤及鄰近正常組織在不同的部位包含所有亞型。惡性細胞主要在腫瘤中被識別出來，而Epi_EDN1（低）細胞在鄰近的正常組織中更為富集。
惡性細胞的HERVs表達水平最高。為了進一步探索HERVH的異常激活，構建了一個明確的惡性和非惡性上皮細胞的轉錄軌跡。在隨著腫瘤進展而顯示轉錄改變的HERVs中，HERVH家族的HERVH-int、LTR7Y和LTR7的意義最高，提示HERVH可能是一種早期GBC診斷的生物標志物。鑒定了在惡性細胞中與這些HERVH元件表達相關的基因。這些基因在與內質網靶向蛋白、粒細胞趨化性、細胞增殖和分化相關方面高度富集。這些基因表達的改變可能是由HERVH的抑制引起的
HERVs在免疫治療中被高度重視，如免疫檢查點抑制劑，因為它們能夠使腫瘤細胞對免疫識別敏感。HHLA2是一種最近出現的免疫檢查點，被認為是由HERVH衍生出來的。HHLA2被認為在致癌過程中起雙重作用：一種用于免疫刺激，另一種用于免疫抑制。檢測了上皮細胞亞型中HHLA2的轉錄，以及腫瘤細胞中可能表達的一些免疫檢查點。HHLA2在Epi_EDN1（高）（代表ICS）和惡性細胞中均有表達，且高于PD-L1（CD274），這是研究最多的免疫檢查點。PD-L1轉錄的弱信號可能至少部分解釋了針對PD-L1的免疫治療在一些GBC患者中的有限療效有限。HHLA2在中間細胞和惡性細胞中表達水平的升高及其在癌變中的雙重作用（一種免疫刺激，另一種免疫抑制）提示HHLA2可能是GBC治療的良好候選藥物。此外，我們發現了HHLA2和HERVH元件的表達相關性，這意味著將旨在誘導HERVH激活的DNA去甲基化劑與靶向HHLA2治療相結合可能是一種很有前途的治療策略。
Fig 3. 惡性轉化過程中惡性細胞的鑒定及HERVH的抑制
4. 增殖T細胞顯示出異常高的HERV表達
T細胞在TME中表現出細胞組成和功能狀態的異質性。T細胞被進一步劃分為7個不同的亞群。與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中naïve CD4+ T和CD4−/CD8−T細胞比例減少，增殖T和調節性/耗盡的CD4+ T細胞比例增加。更多的調節性/耗盡的CD4+ T細胞在腫瘤組織中積累，表明在腫瘤進展過程中從免疫激活到免疫抑制的變化。
HERVs在不同亞型的T細胞中均有不同水平的表達。將來自腫瘤組織的細胞與來自鄰近正常組織的細胞進行比較時，除初始CD4+ T和CD4+ Th細胞外，所有T細胞亞型中均觀察到顯著的HERV轉錄變化。HERVH相關元件、LTR13A、MER41B、LTR12C和MLT1D在來自腫瘤組織的增殖T細胞中表達上調。與HERVH上調相關相關基因與T細胞活化相關。
此外，在腫瘤組織中也檢測到HERVH在調節/耗盡CD4+ T細胞中高表達，在CD8+ T GZMB和LTR7Y和CT在CD4−/CD8−T細胞中高表達。
Fig 4. 增殖性T細胞顯示HERVs的顯著表達水平
5. 血漿B細胞中IgG基因與MLT1C位點的關聯
浸潤TME的B細胞在調節腫瘤免疫中發揮著多方面的作用。B細胞亞型鑒定出三種主要的細胞亞群。這些B細胞亞群的組成在GBC和正常樣本之間是不同的。在GBC中，漿細胞的相對比例增加，而濾泡B細胞在正常樣本中富集，并在鄰近正常組織中占B細胞的大部分。直接比較各B細胞亞型在GBC和正常組織中HERVs的表達水平，發現腫瘤來源的濾泡B細胞和血漿B細胞表現出HERV轉錄豐度的增加。與非腫瘤來源的濾泡B細胞相比，腫瘤細胞中HERVH-int和MSTC的表達水平更高。漿B細胞是終末分化的B細胞，可以分泌抗體，是其重要組成部分。發現了一個MLT1C位點與鄰近的IgG基之間的轉錄關。這兩種基因的表達關聯和上調可以推測MLT1C-dup586-chr14可能是促進這些鄰近IgG基因表達的調控因子。
Fig 5. IgG基因與血漿B細胞中鄰近的MLT1C位點相關
6. HERVH在所有髓系細胞類型中的過表達
髓系細胞被分為單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞。根據突出的表達標記物進一步分為常規DC（cDC1和cDC2）、單核細胞來源的DC（mo-DC）和成熟DC。對于腫瘤和鄰近組織，cDC2和mo-DC占樹突狀細胞的大多數，mo-DC和成熟的DC在GBC組織中富集，而cDC1s和cDC2s則被耗盡。不同DC亞型間的HERV表達模式有所不同。GBC中cdc1和mo-樹突狀細胞HERV的表達顯著升高，而cdc2和成熟樹突狀細胞的表達無顯著差異。Mo-DCs被認為是來自于炎癥或感染背景下的單核細胞，該亞群可以在各種腫瘤模型中誘導T細胞激活。LTR7Y在來自GBC組織的mo-DCs中過表達。在mo-DCs中與LTR7Y表達模式相似的基因主要與抗病毒應答和T細胞活化有關，提示mo-DCs抗病毒和炎癥能力的增強可能受到LTR7Y的調控。
此外，LTR7Y與MMP7基因表現出很強的相關性，MMP7作為一種致癌因子介導幾種癌癥的發生和進展。這種關聯也在惡性細胞、增殖T細胞、T細胞和巨噬細胞中可見。在其他髓系細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞中也觀察到HERVH元素的表達顯著增加。綜上所述，HERVH元素在幾乎所有的髓系細胞類型中都表達上調，它們可能對髓系細胞的行為和功能有類似的影響。
Fig.6 髓系細胞中HERVH的活化
7. MER65-int在成纖維細胞中被激活，并與ECM基因有表達相關性
腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）是腫瘤間質中最主要的組成部分之一，具有異質性的表型和功能。成纖維細胞分成了2種主要不同的亞型，包括炎癥性CAFs（iCAFs；FDGFRA）和肌癌相關的成纖維細胞（myoCAFs；RGS5）。在GBC組織和鄰近正常組織中，iCAFs是主要的細胞類型。與正常組織相比，GBC組織中myoCAFs的比例增加，而iCAFs的水平略有下降。在HERV的表達水平方面，腫瘤中iCAFs和myoCAFs均顯著升高。篩選了GBC中異常激活的HERV。對于iCAFs，MER65-int、MER4D0和MER4- int是上調最多的HERV。在位點水平上，MER65-int-dup5-chr19在iCAFs中與其鄰近基因CEACAM5相關。CEACAM5編碼癌胚抗原（CEA），已被用作臨床檢測的腫瘤生物標志物。在GBC-來源的巨噬細胞中也觀察到了這種關。對于myoCAFs，在GBC來源的細胞中特異性激活的MER65-int顯示出與ECM組織相關的基因的相關性。這表明活躍的MER65-int可能參與了ECM基因的失調。在來自GBC組織的內皮細胞中，MER50、LTR7C、LTR6A和MLT1A0表達上調。然而，這些HERV家族如何影響細胞功能尚不清楚。
Fig 7. MER65-int在成纖維細胞中的活化
參考文獻：
Wang J, Ren M, Yu J, Hu M, Wang X, Ma W, Jiang X, Cui J. Single-cell RNA sequencing highlights the functional role of human endogenous retroviruses in gallbladder cancer. EBioMedicine. 2022 Nov;85:104319. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104319IF: 11.1 Q1 . Epub 2022 Oct 29. PMID: 36374772IF: 11.1 Q1 ; PMCID: PMC9626538IF: 11.1 Q1 .