期刊：Plant Methods
影響因子：4.4
通訊單位：華大基因
通訊作者：姜三杰
伯豪技術產品：伯優®植物樣本細胞核分離試劑盒
引言
植物單細胞測序困局：優化抽核方案如何重塑轉錄組學研究的精準度？
在植物生物學研究領域，單細胞轉錄組技術正以前所未有的分辨率揭示細胞異質性與基因調控網絡的復雜性。然而，這項技術在植物樣本中的應用仍面臨諸多挑戰：細胞壁的酶解效率、原生質體分離過程中的脅迫響應、不同組織類型的可及性差異，以及核轉錄組與全細胞轉錄組之間的系統性偏差，都讓研究者們在實驗設計和數據解讀上面臨著艱難抉擇。
近日，發表于《Plant Methods》的一項研究為我們提供了一份詳盡的路線圖。來自多家機構的研究團隊系統性地比較了玉米葉片和根尖組織中，基于原生質體、新鮮細胞核及冷凍細胞核的單細胞轉錄組學工作流程。值得注意的是，該研究通過使用優化的核制備方案——包括采用商品化細胞核制備試劑盒進行改良——成功克服了植物組織中核RNA-seq的多個技術瓶頸，為理解植物細胞異質性提供了更全面、更精準的視角。
主要產品
伯優®植物樣本細胞核分離試劑盒
（技術產品伯豪生物提供）
主要研究
從“單細胞”到“單核”：植物轉錄組學的范式演進
植物細胞因其堅韌的細胞壁和液泡結構，使得完整的原生質體制備過程既是一門藝術，也是一種挑戰。傳統的原生質體分離雖然能捕獲較為完整的轉錄組信息，但酶解過程不可避免會誘導應激基因的表達，且難以應用于木質化程度高或深層組織的研究。相比之下，單核RNA測序通過直接分離細胞核，規避了原生質體制備的諸多限制，尤其適用于難以解離的樣本或需要進行空間轉錄組驗證的研究場景。
本研究的核心貢獻之一，在于其對核分離流程的系統性優化。研究團隊在核分離緩沖液中添加了RNase抑制劑和DTT，以最大程度保持核內RNA的完整性。更重要的是，他們針對不同組織類型采用了差異化的純化策略：對于富含次生代謝物和葉綠體的葉片樣本，采用FANS分選獲得高純度細胞核；而對于結構相對簡單的根尖組織，則采用密度梯度離心進行富集。這種精細化的操作不僅保證了核得率，更為后續高質量的測序數據奠定了基礎。
數據質量：核轉錄組能否媲美原生質體？
對于習慣于全細胞轉錄組的研究者而言，核RNA-seq最令人擔憂的問題莫過于數據質量的下降。本研究的測序數據給出了令人信服的答案。
在單細胞/單核水平上，研究團隊使用了優化的DNBelab C4平臺進行文庫構建。從表2的統計數據可以看出，盡管原生質體樣本在平均每個細胞檢測到的基因數（如根原生質體達4,000以上）和UMI計數方面仍保持優勢，但冷凍核樣本的表現已相當可觀。例如，根冷凍核樣本平均檢測到的基因數超過3,000，UMI計數超過5,000，這一指標顯著優于新鮮核樣本，且與以往發表的植物snRNA-seq研究相比處于較高水平。
這種提升直接歸因于核分離流程的優化。在核分離過程中，使用含有高質量RNase抑制劑的緩沖液以及溫和的研磨與純化步驟，最大限度地減少了內源及外源RNase對RNA的降解。圖4中基因體覆蓋度曲線清晰地顯示，雖然核樣本相較于原生質體存在一定的3‘端偏好性（提示存在部分降解），但冷凍核樣本的覆蓋度曲線明顯優于新鮮核樣本，表明液氮速凍結合優化的分離流程能夠更好地維持轉錄本完整性。
更重要的是，研究團隊開發了一套與單細胞測序化學體系高度匹配的批量RNA-seq流程，為單核數據的解讀提供了可靠的參考基準。表1的批量測序數據表明，核樣本（尤其是冷凍核）的基因組比對率超過90%，基因比對率也達到60%以上。盡管核樣本中不可避免地存在一定比例的rRNA污染（表S2，葉片FANS純化的核樣本rRNA比例為5.44%-9.09%），但這并不妨礙高質量的蛋白編碼基因捕獲。主成分分析（圖4d）顯示，不同制備方法的樣本在相同組織內緊密聚集，證明優化后的核分離方案能夠很好地保留組織特異的轉錄組特征。
圖4. 不同樣本制備類型的bulk RNA-seq文庫評估
表2. 單細胞RNA-seq統計數據概覽
細胞組成：核數據如何揭示被“遺漏”的關鍵細胞類型？
單細胞技術的終極目標是還原組織真實的細胞組成。本研究最引人注目的發現之一，在于核數據在捕獲特定細胞類型方面的獨特價值。
在葉片樣本中，原生質體數據幾乎被葉肉細胞主導（占比超過90%），而維管束鞘細胞的比例極低（圖5b, c）。然而，已知的植物解剖學知識告訴我們，維管束鞘細胞作為C4植物的關鍵功能單元，其在葉片中的占比不應如此之低。相比之下，核數據（無論是新鮮核還是冷凍核）捕獲了顯著更高比例的維管束鞘細胞（新鮮核中占20.3%，冷凍核中占32.5%）。圖5e的葉片冰凍切片證實了維管束鞘細胞在組織中的實際分布，表明核數據更準確地反映了體內細胞組成。這一發現具有深遠的生物學意義：對于研究C4光合途徑、代謝物運輸的學者而言，僅依賴原生質體數據可能會完全遺漏關鍵細胞類型的信息。
類似的情況在根尖樣本中表現得更為突出。圖6a, c顯示，根冠細胞僅在核數據中被捕獲，而原生質體數據中完全缺失。根冠作為保護根尖分生組織的重要結構，其細胞的黏附性和特殊細胞壁成分使其在酶解過程中極易丟失。通過核分離，研究者能夠首次在單細胞水平上解析這些“頑固”細胞類型的轉錄組特征。圖6e對根冠細胞UMAP的可視化，結合已知柱細胞標記基因的表達，進一步驗證了核數據在解析稀有細胞類型亞群方面的潛力。
圖5. 葉片樣本單細胞轉錄組數據的細胞類型注釋及分布
圖6. 根尖樣本單細胞轉錄組數據的細胞類型及注釋分布
解讀挑戰與應對策略：如何駕馭核轉錄組數據？
盡管核數據在細胞類型覆蓋上具有優勢，但其本身也帶來了新的分析挑戰。本研究的系統性評估為如何應對這些挑戰提供了實用指南。
首先是TSO假象問題。由于核樣本中mRNA豐度低、片段較短，反轉錄過程中容易產生非特異性擴增產物。研究團隊展示了使用Cutadapt進行TSO序列去除的策略，成功識別并過濾了含有TSO串聯體的reads（圖S7），顯著提升了數據利用率。
其次是背景噪音問題。由于核分離過程中可能會吸附環境中的游離RNA，核數據的背景噪音水平通常高于原生質體。圖7c顯示，SoupX估算的核樣本污染比例（14%-52%）遠高于原生質體樣本（5%-7%）。為解決這一問題，研究團隊嘗試了CellBender進行背景校正。雖然校正后的數據（圖S8）成功抑制了某些高豐度基因的污染，但也付出了靈敏度下降的代價，甚至丟失了原生質體中特有的某些細胞類型標記。這一發現提醒我們：背景校正工具的使用需要權衡利弊，尤其是在探索性研究中，直接丟棄背景或過度校正可能會掩蓋真實的生物學信號。研究團隊的建議是，當條件允許時，整合原生質體與核數據可能是構建完整、可靠的植物細胞圖譜的最優策略。
圖7. 不同樣本制備方式轉錄組特征的質量評估與比較
轉錄因子表達：一個需要高度警惕的技術偏差
本研究的一個意外發現是，轉錄因子表達譜的聚類分析（圖S5）顯示，樣本首先按制備方法（原生質體、新鮮核、冷凍核）聚類，而非按組織來源。這一現象揭示了不同分離方法對核內轉錄調控網絡解析可能產生系統性影響。盡管研究團隊未能找到顯著富集的特定TF家族，但這仍然是一個值得高度關注的警告：在進行細胞身份注釋或調控網絡推斷時，方法學本身引入的偏差可能會被誤讀為生物學差異。這進一步強調了在研究設計中保持方法一致性、以及在進行跨數據集比較時充分考慮技術變量的重要性。
結論
從玉米出發，走向更廣闊的植物單細胞世界
本研究以玉米B73自交系為材料，通過系統性比較原生質體、新鮮核與冷凍核的工作流程，為植物單細胞轉錄組學提供了寶貴的實驗指南。研究數據表明，優化的核分離方案——特別是基于高質量商品化試劑盒的改良流程——能夠在保證數據質量的同時，顯著提升對特定細胞類型（如維管束鞘細胞、根冠細胞）的捕獲能力。
對于廣大植物科研工作者而言，這項研究傳遞了幾個關鍵信息：
原生質體仍然是追求最高靈敏度和轉錄本覆蓋度的首選，尤其適用于研究葉肉細胞等易解離的細胞類型。
當研究目標涉及難以解離的深層組織、木質化細胞，或需要保留細胞的空間位置信息時，冷凍核樣本結合優化的分離與純化流程，是極佳且可靠的替代方案。
在有限條件下，新鮮核也可作為備選，但需嚴格遵守低溫操作規范，并預期其數據質量（尤其是基因檢出率）會略有下降。
轉錄因子表達等分析對樣本制備方法高度敏感，需要在數據解讀時格外謹慎。
整合原生質體與核數據進行綜合分析，可能是構建最全面、最準確的植物細胞圖譜的未來方向。
隨著單細胞技術向更多非模式植物物種拓展，本研究提供的優化方案和數據質量評估無疑將成為科研人員在選擇實驗策略時的重要參考。當我們面對植物體內那些難以觸及的細胞類型時，一管高質量分離的細胞核，或許就是打開新世界大門的那把鑰匙。而這一切的起點，正是一次精心設計、嚴格質控的核分離實驗。
參考文獻：
Wang J, Zheng S, Lu B, et al. Integrated experimental and computational workflows for single-cell transcriptomics in plants. Plant Methods. 2026;22(1):12. Published 2026 Jan 3. doi:10.1186/s13007-025-01490-6
本產品適用于新鮮植物樣本的細胞核分離。通過裂解細胞膜，釋放細胞核的同時保持細胞核膜的穩定，經密度梯度離心快速地從植物樣本中分離純化細胞核，并減少碎片及次生代謝產物的殘留。