影響因子：6.2
伯豪技術服務：單細胞轉錄組測序
研究背景
胃癌（GC）是全球癌癥相關死亡的第三大原因，預后普遍較差。胃癌干細胞（GCSCs）因其自我更新能力、異質性分化潛能以及對化療和靶向治療的強耐藥性，被認為是腫瘤發生、進展、復發和治療抵抗的關鍵驅動因素。盡管靶向Wnt/β-catenin信號通路（GCSCs干性和耐藥性的核心調控通路）是極具前景的策略，但目前缺乏臨床可用的有效抑制劑。
主要技術
單細胞轉錄組測序
（技術服務由伯豪生物提供）
實驗材料
人類GC細胞系（MGC-803、SGC-7901、BGC-823、MKN-45）；4至6周齡雄性裸鼠。
結論
通過高通量篩選臨床獲批藥物庫，發現抗生素藥物氯?？朔樱–lofoctol, CFT） 能高效抑制β-catenin表達，顯著削弱GCSCs干性，并通過結合RanBP2蛋白誘導TNF介導的程序性壞死，為胃癌治療提供了新的候選策略。
實驗結果
1. 高通量篩選鑒定CFT為強效β-catenin抑制劑
篩選策略： 使用實時定量PCR（RT-qPCR）檢測206種FDA批準的無明確靶點藥物對胃癌細胞系MGC-803中β-catenin mRNA水平的影響。
關鍵發現：
10種藥物（4.85%）能將β-catenin mRNA抑制至對照組50%以下（圖1A, B）。
CFT表現出最強的抑制效果，顯著降低多個GC細胞系（MGC-803, SGC-7901, BGC-823, MKN-45）的β-catenin mRNA和蛋白水平（圖1C，附圖S1A）。
細胞效應初探：
常規培養下，CFT（≤10 μM）在前48小時對細胞活力和凋亡無顯著影響（附圖S1B-D）。
營養應激增強CFT效應： 在低血清（1% FBS）模擬的微環境壓力下，CFT處理7天后顯著抑制GC細胞增殖，誘導S期阻滯并促進細胞凋亡（圖1D-F，附圖S2A-C）。
協同化療： CFT與5-氟尿嘧啶（5-Fu）聯用表現出顯著的協同抗腫瘤效應（附圖S2E, F）。
圖1. CFT在低血清培養基中抑制β-catenin和細胞生長
2. CFT有效抑制GCSCs干性及致瘤性
干性標志物下調： CFT處理顯著降低干性相關基因（Nanog, Oct4, Survivin, Sox2, Lgr5）的mRNA表達（圖2A）。
自我更新能力受損：
體外球體形成： CFT處理顯著降低GC細胞形成腫瘤球體的頻率和能力（圖2B，附圖S3A, B）。
集落形成： CFT處理顯著減少GC細胞的貼壁依賴性集落形成單位（CFU）（圖2D）。
GCSCs標志物減少： 流式細胞術（FCM）分析顯示，CFT處理顯著降低CD44?/CD133?雙陽性細胞群以及高醛脫氫酶活性（ALDH?）細胞群的比例（圖2E, F，附圖S4A, B）。
體內致瘤性減弱：
有限稀釋實驗： 將不同數量（10?, 10?, 10?）的GC細胞皮下接種裸鼠，CFT處理組形成的腫瘤更少、更小，表明CFT降低了具有腫瘤起始能力的細胞比例（圖2G）。
次級移植瘤實驗： 將CFT處理組來源的原代腫瘤細胞再次接種小鼠，形成的次級腫瘤數量和體積顯著小于對照組，證明CFT處理可長期抑制腫瘤再生能力（圖2H）。
遷移侵襲抑制： CFT通過下調上皮間質轉化（EMT）相關蛋白抑制GC細胞的遷移和侵襲能力（附圖S5A-D）。
圖2. CFT在體內和體外抑制GC細胞干性
3. CFT選擇性殺傷GCSCs并誘導凋亡/壞死
模型建立： 從4株GC細胞系和2例GC患者原代細胞中分離培養GCSCs。
選擇性殺傷：
CFT（10 μM）能顯著抑制6種不同來源GCSCs的活力，而同等劑量對普通GC細胞或正常細胞（HUVEC, 293T, GES-1, H9）影響甚微（圖3A-C，附圖S6A, B）。
GCSCs通常對化療藥5-Fu和順鉑（Cis）耐藥，但CFT對其表現出強效殺傷作用（圖3A）。
誘導細胞死亡：
FCM（Annexin V/PI）和Calcein-AM/PI活死染色證實CFT顯著增加GCSCs的凋亡/死亡細胞比例（圖3D, E，附圖S6C, D）。
人凋亡抗體芯片： CFT處理改變多個凋亡相關蛋白表達，包括Caspase-3、HSP27、CytoC、FasL、Survivin和XIAP（圖3F，附圖S6E）。
活性氧積累： CFT誘導GCSCs內活性氧（ROS）顯著累積（附圖S6F）。
體內抗GCSCs活性：
裸鼠移植瘤模型： 將SGC-7901來源的GCSCs接種裸鼠，腫瘤體積達50 mm³后腹腔注射CFT（30 mg/kg/天，連續11天）。CFT顯著抑制腫瘤生長，且不顯著影響小鼠體重（圖4A-D）。
機制驗證：
免疫組化/免疫熒光：CFT處理組腫瘤中Cleaved Caspase-3表達升高（凋亡增加），CD44?/CD133?細胞比例降低（干性減弱）（圖4E-G）。
單細胞RNA測序（scRNA-seq）： 分析CFT處理組腫瘤細胞組成，發現具有高干性基因（NEAT1, COL7A1, MALAT1, IMMP2L）特征的細胞簇（Cluster 5）比例顯著減少，且該簇細胞處于分化早期（圖4H-K，附圖S7C-E）。
圖3. CFT抑制GCSC活率并誘導凋亡
圖4. CFT在體內誘導GCSC凋亡
4. 分子機制：靶向RanBP2調控SerpinE1/β-catenin軸與TNF壞死通路
RNA-seq揭示關鍵通路：
CFT顯著下調SerpinE1（與GC不良預后正相關）表達（圖5B，附圖S9A-D）。
CFT顯著上調TNF表達，并富集到“細胞因子-受體相互作用”、“凋亡”和“壞死性凋亡”相關通路（圖5D-F，附圖S8C-F）。
蛋白互作（PPI）網絡分析確認TNF是調控凋亡/壞死網絡的核心節點（圖5G）。
qRT-PCR驗證CFT上調多個壞死性凋亡相關基因（TNF, IL6, IL18等）（圖5H, I）。
圖5. SerpinE和TNF是CFT的靶點
SerpinE1是CFT抑制干性的關鍵下游因子：
回補實驗：在GC細胞中過表達SerpinE1，可部分逆轉CFT對β-catenin的下調作用（圖6A，附圖S9E-G）。
過表達SerpinE1顯著上調干性基因（Nanog, Oct4等）表達，并增強集落形成、球體形成和致瘤能力，而CFT處理能拮抗這些效應（圖6B-G，附圖S9H, I）。
圖6. SerpinE1與CFT介導的GC細胞干性抑制有關
CFT激活TNF介導的程序性壞死（Necroptosis）：
CFT顯著上調GCSCs中TNF mRNA和磷酸化RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白水平（圖7B, C）。
使用特異性RIPK1抑制劑Necrostatin-1 (Nec-1) 可劑量依賴性地阻斷CFT誘導的TNF上調和細胞凋亡/壞死（圖7D, E），證明CFT通過TNF-RIPK1/RIPK3/MLKL通路誘導GCSCs壞死性凋亡。
圖7. CFT誘導TNF介導的GCSC壞死性凋亡
CFT直接靶向結合RanBP2：
網絡藥理學與分子對接： 預測出25個CFT潛在靶點，PPI網絡分析及GC表達數據提示RanBP2（SUMO E3連接酶）是關鍵候選靶點（圖8A，附圖S10A-H）。
分子對接： CFT通過氫鍵與RanBP2的PHE-110殘基穩定結合（圖8B）。
DARTS驗證： CFT結合可保護RanBP2蛋白免受蛋白酶降解（圖8C）。
分子動力學（MD）模擬： 模擬CFT-RanBP2復合物100 ns動態，顯示復合物RMSD、Rg、RMSF值穩定，結合自由能分解確認PHE-110等殘基對結合貢獻大，證實兩者結合穩定（圖8D-H，附圖S10I）。
功能驗證： 敲低RanBP2：
特異性降低SUMO1（而非SUMO2/3/4）蛋白水平（附圖S10K）。
逆轉CFT對SerpinE1、β-catenin和SUMO1的下調作用（圖8I），證明RanBP2是CFT發揮功能的上游靶點。
圖8. CFT與RanBP2結合調控靶蛋白
5. 機器學習構建CFT療效預測模型
模型構建：基于RNA-seq數據，應用Lasso回歸（LR）、支持向量機（SVM）和隨機森林（RF）三種機器學習算法篩選特征基因。
核心基因：整合分析得到77個候選基因，進一步結合TCGA胃癌轉錄組數據，最終確定13個基因構成預測模型（附圖S11A-C）。
預后價值：
根據風險評分將TCGA胃癌患者分為高風險組和低風險組。高風險組患者總生存期（OS）顯著短于低風險組（P=0.00336）（附圖S11D）。
多因素Cox回歸確認年齡、腫瘤分期和風險評分是獨立預后因素（附圖S11F）。
風險評分對3年內預后具有良好預測價值（ROC曲線下面積AUC=0.627）（附圖S11E, I）。
列線圖整合風險評分與臨床特征，可直觀預測患者生存（附圖S11G, H）。
總結
靶點結合：CFT直接結合SUMO E3連接酶RanBP2。
干性抑制：通過RanBP2下調SerpinE1表達，進而抑制β-catenin信號通路，削弱GCSCs干性、自我更新和致瘤能力。
誘導死亡：通過RanBP2激活TNF介導的RIPK1/RIPK3/MLKL依賴性程序性壞死途徑，選擇性殺傷耐藥性GCSCs。
預測工具：基于13個基因的機器學習模型可預測胃癌患者預后及潛在CFT治療反應。
臨床轉化價值：
老藥新用：CFT作為已獲批的抗菌藥物，其安全性已知，重新定位用于胃癌治療可加速臨床轉化。
靶向GCSCs：CFT能有效清除對傳統化療耐藥的GCSCs，為克服胃癌復發和轉移提供了新策略。
聯合治療：CFT與化療藥物（如5-Fu）聯用展現協同效應，具有臨床聯合用藥潛力。
圖9. 機制圖：CFT與RanBP2結合，誘導壞死性凋亡，抑制干性
參考文獻：
Liu Y, Ma Y, Zhou B, et al. Clofoctol impairs the stemness of gastric cancer and induces TNF-mediated necroptosis by directly binding to RanBP2. Cell Mol Life Sci. 2025;82:194.