類器官是干細胞衍生的體外3D自組織培養物，與來源組織擁有分子機制與結構功能的相似性，因此已經在發育生物學、藥物發現和再生醫學領域展現出巨大潛力。然而，當前類器官（尤其是神經類器官）血管化技術仍不成熟，球體直徑生長到約150μm時，由于缺乏血管網絡的支持，氧氣、營養物質、代謝物、信號分子擴散不足，類器官中會出現缺氧和代謝物堆積，從而導致細胞增殖停滯和核心區域的壞死。在培養第60天的球狀中腦類器官中便有超過50%的類器官細胞缺氧或壞死，腦類器官的功能和表型尤其受限，與人腦體內的生理機能仍有較大差距，無法精準進行疾病和藥效表征。

目前，血管化技術正在不斷突破?？尚械穆肪€包括加入促進血管生成的細胞因子（如VEGF）、與血管內皮細胞共培養、氣液界面切片培養以及工程化技術等。不過，這些過往的技術方法仍欠缺簡便性與高效性。

2025年3月17日，美國印第安納大學及其合作團隊在期刊Cell Stem Cell發表論文“Vascular network-inspired diffusible scaffolds for engineering functional midbrain organoids”，創新性地開發了一種受血管網絡啟發的可擴散支架（VID支架）。該支架具有生物相容性，成本低廉、堅固耐用，可批量制造，并可模擬生理擴散，從而生成幾乎不出現壞死和缺氧現象的工程化的神經類器官（ENOs），顯著增強了類器官的生理功能和藥物篩選的準確性。

研究團隊使用生物相容性塑料，通過3D打印在孔板上高通量生成了網狀管腔網絡。接下來，研究人員模擬原代人腦組織中的信息和物質擴散，在獲得的VID支架上培養類胚體（embryonic body，使用已充分表征的中腦類器官方案，培養過程中添加了FGF-8b、BDNF、GDNF等細胞因子）以獲得ENOs。

與最初的設計一致，類器官內所有細胞到最近的可擴散表面的距離均不超過150μm，可保證充足的營養和氧氣供應，細胞基本處于健康狀態，無缺氧壞死現象，與常規神經類器官（CNOs）存在顯著差異。

圖1：在VID指甲上聲張的腦類器官成功發育以形成多個腦室區（VZ）結構為特征

為了進一步證明VID支架切實地利用擴散管網絡直接向類器官細胞提供了營養物質、氧氣和信號分子，研究人員隨后對其進行了全面表征。定量染色結果再次強調，ENOs直至培養第180也未出現缺氧現象，且三種不同分子量的生長因子在灌注后均勻且高效分布于ENOs?？偟膩碚f，培養過程中ENOs內部細胞的氧氣供應充足，缺氧區域顯著減少，細胞活力顯著提高。

圖2：ENOs中介質、氧和信號分子的擴散增強

在培養第15到第180天是神經祖細胞（NPC）擴展和神經成熟的關鍵階段，在ENOs和CNOs中均觀察到了成熟神經元和VZ標志物的發生。但CNOs在第15天開始出現明顯的壞死核心，從第15天到180天繼續擴大。而ENOs缺乏壞死核心，在同一時間內非壞死增殖區也顯示較少的細胞死亡。此外，但ENOs在60-180天的增殖細胞比例（ki67）高于CNOs，表現出更強勁的發育態勢。

scRNA-seq測序分析顯示，與傳統類器官相比，ENOs中的神經前體細胞具有更低的內質網應激、缺氧和凋亡相關基因的表達，而與細胞周期、DNA復制和神經元發育相關的基因表達更高，表明ENOs的神經新生更為頻繁與持續。

圖3：VID支架維持了ENOs中的神經新生

需要注意的是，隨著CNOs中的細胞死亡與應激的發生，細胞類型的分化也受到了嚴重限制。相較而言，ENOs VZ中存在更高比例的LMX1A多巴胺能祖細胞（46%對比23%）。在整體非壞死區域內，ENOs也擁有更高比例的多巴胺能神經元（37%對比25%），且這些神經元在類器官中的分布更加均勻，形成了更復雜的神經網絡結構。進一步的分析顯示，ENOs與原代人胚胎中腦具有更高的相似性。與CNOs相比，ENOs中未識別細胞（5%對比14%）和非多巴胺能神經元（8%對比19%）減少，多巴胺能神經元（22%對比15%）和祖細胞（35%對比28%）增加，中腦特異性標記的基因表達也有顯著上調，表明ENOs中腦特異性神經發生增強。

總之，與傳統類器官相比，ENOs在中腦特異性身份、氧氣代謝、神經元成熟和網絡活動等方面表現出更符合生理特征的功能。

圖4：VID支架增強了中腦區域特異性分化

使用多電極陣列（MEA）系統記錄ENOs和傳統類器官的神經活動，研究人員發現ENOs在培養90天后表現出更均勻的神經活動和更復雜的神經網絡連接。且ENOs的神經元放電頻率、爆發頻率和活躍電極數量均顯著高于傳統類器官，功能連接性也更強，具有定義良好的神經元網絡，整體神經活動顯著優于CNOs。

圖5：VID支架改善了ENOs的神經活動和功能神經網絡

接下來研究人員，研究了ENOs和CNOs對藥物的反應，發現VID支架還解決了靠近MEA電極的神經元可能失去電活動，及藥物難以到達MEA電極附近神經元造成的療效不準的問題。

MEA結果顯示，ENOs在處理后表現出明顯的藥理效應，包括放電事件和爆發次數減少，網絡活動同步性喪失，且相關基因表達變化與藥物作用機制相符。而CNOs在相同處理條件下未表現出顯著的電活動變化。scRNA-seq進一步證實了處理對ENOs中神經元和星形膠質細胞基因表達的影響，表明ENOs在藥物反應方面更符合生理實際情況。

圖6：VID支架增強了藥理學反應

本研究開發的VID支架解決了傳統類器官培養中的擴散限制問題，還能支持類器官在生理灌注樣條件下的長期培養和功能維持，可顯著改善類器官的生理功能和藥物反應表型，為藥物篩選和疾病模型研究提供了更準確的平臺。

作者在最后提到，未來的研究可以集中在開發更先進的生物墨水和高精度3D打印技術，以克服當前支架設計的局限性。此外，將人類臍靜脈內皮細胞或其他來源的內皮細胞整合到支架中，形成更完整的可灌注血管網絡，也是未來研究的一個重要方向。