多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一種常見于中老年人血液系統漿細胞的惡性腫瘤，隨著我國人口老齡化不斷增長，MM發病率呈明顯上升趨勢。當前MM重要臨床問題是耐藥所誘導的復發難治。
中南大學腫瘤研究所周文教授課題組一直致力于該疾病的研究，截止目前已與麥特繪譜合作發表5篇代謝組學研究成果，其中前4篇如下：
① 氮循環菌富集促進MM發?。?em>Microbiome ，2020，麥特繪譜提供非靶向、Q300全定量檢測服務）；
② 腸道肺炎克雷伯菌通過在多發性骨髓瘤中合成谷氨酰胺導致MM肺炎（Cancers，2022，麥特繪譜提供Q300全定量檢測服務）；
③ 首次通過代謝組學發現患者骨髓微環境中氨基酸代謝失衡，甘氨酸是MM的關鍵代謝調節劑，提示通過阻斷甘氨酸攝取、抑制細胞增殖并增強硼替佐米BTZ的作用（Nature communications ，2022，麥特繪譜提供非靶向、Q300全定量、代謝流檢測服務；點此查閱詳細解讀）；
④絲氨酸通過甲硫氨酸循環抑制巨核細胞形成和血小板減少，調控MM進展的分子機制，發現通過靶向血小板減少癥為治療MM患者提供了潛在的治療策略（Nature communications， 2023，麥特繪譜提供非靶向、氨基酸、代謝流檢測服務；點此查閱詳細解讀），提示從代謝角度干預氨基酸來源、攝取和分解可為MM治療提供新思路。
上述研究發現腸道菌群被發現在多發性骨髓瘤（MM）的治療中起著至關重要的作用。然而，MM患者體內富含的腸道氮循環菌在MM復發中的作用仍不清楚。2023年12月18日，麥特繪譜創始人賈偉教授與周文教授團隊在Cell Metabolism發表最新成果（第5篇） Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma 研究論文，首次從代謝失衡解析多發性骨髓瘤發病及耐藥機制，揭示了氮循環腸道菌與宿主代謝互作可誘導多發性骨髓瘤耐藥性，成果成功入選2023年度中國血液學十大研究進展。（麥特繪譜提供代謝流檢測服務）
技術路線
宏基因組聚焦與MM復發相關的菌群
收集28名診斷時患有MM的患者（ADs）、17名復發的MM患者（RMs）和年齡及性別匹配的的20名健康對照組（HC）糞便，進行宏基因組測序，發現MM 患者體內富含特異性弗氏檸檬酸桿菌（C. freundii），且C. freundii豐度與MM的復發時間呈負相關，C. freundii豐度高的患者平均治療次數顯著增加。表明，C. freundii的豐度與MM復發的可能性有關。
圖1. 高豐度的氮循環菌C. freundii與MM復發有關
C.freundii誘導MM患者體內NH4+的積累
通過糞菌移植（FMT）實驗，將MM患者的糞便移植到MM腫瘤小鼠體內后加速了小鼠MM的發展。用硼替佐米（BTZ）處理小鼠后，移植的腸道菌群減弱了BTZ的抗腫瘤作用。
由于C. freundii是已知的氮循環菌，推測C. freundii在氮代謝中的作用可能與其對MM耐藥性有關。同時發現定植組小鼠盲腸內容物和血清中的NH4+濃度均升高，且盲腸和血清NH4+濃度之間顯著正相關，C. freundii的豐度與盲腸內容物和血清中的NH4+呈正相關。在移植了MM患者糞便的小鼠體中獲得一致結果。結果表明C. freundii介導了NH4+的積累。
圖2. C. freundii誘導MM中NH4+的積累
NH4+積累加速MM進展并誘導其耐藥性
臨床發現在MM患者中38% 的患者外周血NH4+水平較高；根據糞便 NH4+的中位濃度將RM樣本分為兩組（低NH4+和高NH4+），發現高NH4+的RM表現出更晚的骨髓瘤分期（Durie-Salmon，DS）。細胞水平上，將MM細胞系（ARP1和H929）在含有不同濃度的NH4+的培養基中培養，發現0.5 mM NH4+增強MM細胞的增殖；在培養基中添加BTZ，發現NH4+處理降低BTZ對MM細胞的抗腫瘤作用。MM動物模型上，補充NH4Cl顯著加速MM小鼠進展?？傊?，NH4+積累可加速MM的進展并誘導對BTZ的耐藥性。
C. freundii通過表達脫氨酶增加NH4+的產生
在C. freundii參考基因組中發現了由C. freundii轉錄的特異性高表達脫氨酶編碼基因。構建該基因缺失菌株 并對小鼠進行灌胃發現在動物盲腸內容物和血清中NH4+水平降低。隨后用C. freundii野生型和突變型定植小鼠，發現野生菌株促進MM進展，而突變菌抑制MM進展。用BTZ處理后，與野生菌組相比，突變菌組MM緩解，而回補NH4+后，突變菌組MM表型逆轉?？傊?，C. freundii通過表達脫氨酶產生了大量NH4+，腸道中產生的NH4+進入血液循環并最終導致MM細胞對BTZ的耐藥性。
圖3. C. freundii介導的NH4+合成誘導對BTZ的耐藥性
NH4+通過穩定NEK2誘導對BTZ的耐藥性
已報道，NH4+的兩個轉運體分別由NKCC1和NKCC2基因編碼，而只有NKCC1（別名 SLC12A2，solute carrier family12，溶質轉運蛋白）在ARP1和 H929 MM細胞中表達，其表達水平在NH4Cl處理過程中逐漸升高。且在高SLC12A2 表達的MM患者中預后較差。在SLC12A2敲除的慢病毒以及SLC12A2敲除的MM小鼠模型中，SLC12A2的缺失減少對NH4+的攝取，誘導細胞凋亡，并抑制NH4+對BTZ的抑制作用。
為了探索NH4+被吸收后的代謝命運，通過代謝流技術示蹤了用15NH4Cl培養的ARP1細胞的氮代謝，發現大多數氨基酸在培養12小時后被標記。其中，5種氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸），在30分鐘后發生顯著改變。隨著NH4+濃度增加，ARP1和H929細胞中NEK2蛋白水平逐漸升高。NH4+可與多種氨基酸結合，增強 NEK2的乙?；?，同時減少NEK2泛素化，進而減弱NEK2的降解，誘導MM細胞對BTZ的耐藥性。
圖4. NH4+通過穩定NEK2誘導對BTZ的耐藥性
呋塞米鈉及益生菌可改善MM的BTZ耐藥性
呋塞米鈉（Fus），一種環狀利尿劑，Fus能以劑量依賴的方式下調ARP1和H929細胞中SLC12A2的表達，抑制MM細胞對NH4+的攝取，改善MM細胞對BTZ的耐藥性。臨床上，Fus治療的MM患者獲得了更長的無進展生存期和更高的療效評分。
通過灌胃進行丁酸梭菌單菌定植，發現其顯著抑制C. freundii的生長，從而減少了NH4+的產生，減輕了MM細胞對BTZ的耐藥性。
圖5. 呋塞米鈉抑制NH4+攝取可改善BTZ耐藥性
小結
本研究發現復發的MM患者腸道菌群中，氮循環菌C. freundii富集，通過增加血液中的NH4+水平，誘導對BTZ的耐藥性。機制上，NH4+通過跨膜通道蛋白SLC12A2進入MM細胞，通過增加乙酰化、減少泛素化穩定NEK2蛋白，促進其耐藥性。提示C. freundii和NH4+作為關鍵的MM復發調節因子，為MM的進展和耐藥提供了新的治療靶點。
參考文獻
[1] Alterations of gut microbiome accelerate multiple myeloma progression by increasing the relative abundances of nitrogen-recycling bacteria. Microbiome. 2020.
[2] Intestinal Klebsiella pneumoniae Contributes to Pneumonia by Synthesizing Glutamine in Multiple Myeloma. Cancers. 2022.
[3] Blocking glycine utilization inhibits multiple myeloma progression by disrupting glutathione balance. Nature Communications. 2022.
[4] Excessive serine from the bone marrow microenvironment impairs megakaryopoiesis and thrombopoiesis in Multiple Myeloma. Nature Communications. 2023.
[5] Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metabolism. 2023.
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