CAR-T細胞治療全流程，包括采集病患或者健康供體的外周血單核細胞（PBMC）、T細胞分離激活，T細胞體外基因修飾，CAR-T細胞體外擴增，CAR-T細胞質量監控，CAR-T細胞回輸病患體內這六個主要步驟。

圖1 CAR-T細胞治療工作流程的示意圖^[2]

采集病患或健康供體的外周血單核細胞（PBMC）是CAR-T生產過程中的關鍵步驟之一。供體選擇時，病患供體需考慮其身體狀況及免疫細胞數量是否足夠。健康供體需經過嚴格的健康篩查，確保無傳染病風險。注意操作規范和質量控制，并符合倫理與法律規定。

CAR-T細胞的產生始于通過單采或外周靜脈血收集患者的外周血單核細胞（PBMC）。由于PBMC的組成差異很大，為保證盡量獲得一致的CART細胞，需要利用基于磁珠的技術分離出特定的T細胞亞群，如CD4+、CD8+、CD62L+或CD45RO+T細胞。

許多研究表明，T細胞亞群的選擇是CAR-T細胞治療效果的基礎。在這方面，中央記憶T細胞（TCM）的CAR轉導似乎對體內有效的細胞擴張、存活和持久性至關重要^[3]。此外，選擇幼稚或分化程度較低的CD8+T細胞進行轉導可以使輸注后T細胞增殖和體內持久性增加。

無論是否采用了T細胞分離過程，都需要T細胞活化步驟來進行充分的轉導和擴增。為了實現這一目標，使用抗CD3和CD28抗體或固定化的CD3和CD28抗體刺激激活T細胞。固定化的抗CD3抗體提供更好的T細胞交聯和活化，而CD28抗體可激活靶細胞中的共刺激信號通路。

圖2 抗CD3/CD28抗體激活T細胞原理示意圖

CD3/CD28抗體偶聯磁珠憑借其高效性和穩定性，成為行業主流選擇。磁珠表面偶聯抗CD3和CD28抗體，分別結合TCR/CD3和CD28受體，提供初級和共刺激信號，模擬天然APC的激活機制，并且通過磁場分離磁珠，避免傳統APC培養的復雜性，且無飼養層細胞需求，為臨床申報提供極大便利性。

近岸蛋白為CGT客戶提供GMP級CD3/CD28 beads(Cat.No.:GMP-B016)，選用直徑為 4.5μm的無孔單分散超順磁性微珠，易于磁化和退磁，操作簡便易去除，確保無磁殘留風險；Anti-CD3抗體是通過成品藥OKT3人源化改造而成，靶向CD3ε；Anti-CD28抗體可以激活T細胞共刺激分子CD28。

Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads (Cat. No. :GMP-B016) , and expanded for 14 days.

（2）激活第5天，細胞活化增殖占比99%以上

The human PBMCs were labeled with CFSE and stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads, and then the proliferation of cells was assessed with CFSE dilution assay by flow Cytometry on day 5 after stimulation.

（3）激活后PD-1表達情況

A.mRNA用于T細胞的基因修飾：

近幾年,mRNA技術快速發展，除了在傳染病疫苗領域快速發展，在腫瘤治療領域也逐漸凸顯出其優勢。通過體外轉錄修飾獲得的轉座子及CRISPR/Cas9系統等mRNA，已被成功用于T細胞基因編輯。

近岸蛋白提供全套mRNA體外轉錄及修飾用酶及試劑，產品符合GMP級生產及質量管理體系，已助力多家企業mRNA疫苗進入臨床階段。所有酶產品通過FDA DMF備案，為客戶中美雙報打下基礎。除酶原料產品外，近岸蛋白還提供自序列設計到LNP包封的高通量篩選CRO服務，為初建mRNA技術平臺的客戶提供快速解決方案。

圖3 近岸蛋白RNA原料及服務助力解鎖體內CAR-T新療法

目前已有幾種成熟的基因轉移平臺，可用于將嵌合抗原受體（CAR）基因引入原代T細胞。轉基因插入可以通過病毒介導的轉導、mRNA轉染，睡美人轉座子、piggyBac轉座子或質粒DNA的非病毒轉染來進行。在臨床基因轉移應用中，病毒載體是在靶細胞中實現感興趣基因穩定表達或基因表達突變的主要手段。

圖5 rAAV病毒載體生產流程示意圖^[5]

在病毒載體的大規模生產純化過程中，核酸殘留成為各類質控標準的重中之重，因為DNA較好的穩定性，容易在生產過程中形成殘留，而最終的生物制品應用到人類疾病預防和治療時，會帶來不可控的危險因素。對于病毒載體在生產過程中產生的核酸，現在大多選擇核酸酶進行去除。

近岸蛋白質提供GMP條件下生產的全能核酸酶（BenzoNuclease），無動物源性，無氨芐青霉素，可高效降解單鏈、雙鏈、線性、環狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。質量、性能、供貨能力可靠，并已完成FDA DMF備案，可以滿足藥物申報的規范。同時提供高性能配套全能核酸酶殘留檢測試劑盒（檢測范圍0.014-10ng/ml），靈敏度高。

不管是原代T細胞還是通過基因修飾獲得的CAR-T細胞，都需要進行大規模的體外擴增，才能獲得達到后續環節以及治療所需劑量。

已有大量文獻指出，細胞因子IL-2/IL-7/IL-15在T細胞增殖、T細胞亞群的生長以及提高CAR-T產品療效和持久性方面發揮重要作用。

Hopkins B等人進行了一項實驗設計，研究不同組合IL-2、IL-7、IL-15對T細胞亞群生長的影響。結果表明，CD4+和CD8+ naïve T細胞分別在中等濃度的IL-2和IL-7組合以及IL-7作用下可以有效生長。CD4+和CD8+記憶細胞分別在中等濃度IL-2和IL-15組合以及中等濃度IL-7和IL-15組合中有利^[4]。Coppola C等研究結果表明IL-2和IL-7在促進活化的CD4+ T細胞的最佳增殖和存活方面存在協同作用^[6]。

近岸蛋白提供GMP級IL-2/IL-7/IL-15細胞因子產品，且已通過FDA DMF備案。如果您使用了近岸蛋白的DMF備案系列產品并需要引用DMF編號，點擊下方按鈕提出授權申請，我們收到申請后，將向FDA提供DMF授權書。

（1）活性數據

Measured in a cell proliferation assay using PHA-activated human peripheral blood lymphocytes (PBL). The ED50 for this effect is 168.10 pg/ml.The specific activity of Recombinant human IL-7 is > 1.0 × 10⁸ IU/mg, which is calibrated against human IL-7 WHO International Standard (NIBSC code: 90/530)

（2）批間穩定性數據

Three independent lots were tested for activity and plotted on the same graph to show lot-to-lot consistency of IL-7.

目前，細胞治療產品的質量控制分為四個大的方面，分別為安全性、純度、效力以及均一性，這些質量控制會貫穿CAR-T生產的各個階段。

其中CAR-T的均一性和純度主要指目標細胞（CAR陽性T細胞）所占的比例。目前有針對CAR不同結構區域的檢測方法，包括針對CAR抗原結合位點的（如CD19抗原或抗scFv抗體），和針對輕鏈或鉸鏈區的（如抗Fab抗體或Protein L）。

近岸蛋白提供CARTEST^® Human CD19-PE Kit(Cat. No.:CT19P)可用于CAR陽性率檢測。此方法利用抗原-抗體特異性反應，可有效降低使用Protein L檢測ScFv存在假陽性率高的問題，使得數據更加真實可靠。

The CD19 CAR-positive rate is greater than 98%.

The CARTEST^® Human CD19-PE Kit (Cat# CT19P) maintains a CD19 CAR-positive rate above 98% after storage for up to 6 months (0, 1, 3, and 6 months tested)

此外，近岸蛋白還可以提供多種類型的CAR-T陽性率檢測試劑盒和靶點抗原，可用于CAR-T陽性率檢測。

CAR-T陽性率檢測試劑盒:

CAR-T靶點抗原：

最終，經質量監控合格達到足夠數量的的CAR-T細胞，經過最后的末端工藝以及細胞凍存，即可回輸病人體內。

以上便是常規CAR-T細胞產品的簡易制備流程。無論使用何種制造模式，成功的CAR-T細胞生產依賴于整體流程的優化。其中所用原料/輔料的合規、高品質十分重要。近岸蛋白提供符合CAR-T臨床制備需求的一系列GMP產品，包括GMP級重組CD3抗體／CD28抗體、GMP級CD3/CD28 beads、GMP級mRNA原料酶、GMP Cas9/AaCas12b^Max/enCas12hf/enCas12Ultra蛋白、GMP級全能核酸酶、GMP級細胞因子（如IL-2/IL-7/IL-15）等，歡迎垂詢！