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乳腺癌是女性中最常見的癌癥之一，是導致女性癌癥致死的主要原因。這其中又以后期骨轉移導致的骨組織癌癥居多，因此研究乳腺癌相關的癌細胞轉移機制就顯得尤為重要。在癌細胞轉移性播散過程中，來自原發腫瘤的乳腺癌細胞必須首先進行上皮-間充質轉化侵染周圍組織，進入血液循環系統的微血管，進而轉移到骨組織內。RUNX2 (Runt-related transcription factor 2, RUNX2)是一種與成骨相關的轉錄因子，已經成為一個重點研究的致癌過程中的轉錄抑制因子。然而，RUNX2在乳腺癌轉移中的作用尚不明確。
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2022年5月9日，黃蔚課題組和王艷課題組在Cell Death & Differentiation上發表題為RUNX2 recruits the NuRD(MTA1)/CRL4B complex to promote breast cancer progression and bone metastasis的研究成果。
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該研究證實了RUNX2促進并結合 metastasis-associated 1 (MTA1)/NuRD和Cullin 4B (CUL4B)-Ring E3 ligase (CRL4B)復合物形成轉錄抑制復合物，催化組蛋白去乙酰化和泛素化。對RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合靶點的全基因組分析確定了包括過氧化物酶體在內的一組基因增殖因子：激活受體α (PPARα)和超氧化物歧化酶2 (SOD2)在細胞生長，上皮-間充質轉化(EMT)和細胞侵襲中起重要作用。
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該研究證明了RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合物促進體外和體內乳腺癌的增殖、侵襲、腫瘤發生、骨轉移、癌干性，表明RUNX2在將來乳腺癌治療發展中可以作為潛在靶點。
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該研究首先通過數據庫分析得出RUNX2上調與乳腺癌發生相關，并且進一步的實驗結果表明RUNX2調節腫瘤抑制基因的表達和參與骨轉移相關信號通路。
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實驗結果顯示了幾個最常見的腫瘤抑制因子在RUNX2被敲減后，基因表達上調，包括BAX, EIF3F, FADD, PPARα，FBXW7, HSP90B1, CASP 7, SIAH2, TNFAIP3，TSC22D1和SOD2。此外，還有幾個癌相關基因在RUNX2被敲減后的細胞中出現下調。這些結果顯示RUNX2可能與乳腺癌的發生有關。
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圖1. RUNX家族在正常及乳腺癌組織中基于GEO和TCGA數據庫的表達分析，結果表明RUNX2在癌細胞的轉錄頻率差異相較于正常細胞最高。
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圖2. RUNX2在乳腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織中的表達。
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免疫親和純化和質譜分析結果表明RUNX2與NuRD(MTA1)和CRL4B復合物相關聯，進一步的純化結果表明NuRD (MTA1)和CRL4B復合體與RUNX2可以直接結合互作。
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圖3. 使用MDA-MB-231細胞FLAG抗體對純化的部分進行Western blotting分析，結果表明NuRD(MTA1)和CRL4B的組分含量較高。
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圖4. RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合體分子相互作用示意圖
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細胞實驗結果表明 RUNX2、MTA1或CUL4B的敲減導致上皮間質轉化相關標記因子 fibronectin、N-cadherin和vimentin的表達減少，并誘導間充質標記因子E-cadherin、α-catenin和γ-catenin的表達，而RUNX2、MTA1或CUL4B的過表達得到的結果剛好相反。
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圖5. MDA-MB-231細胞中RUNX2、MTA1或CUL4B敲減或過表達后相應上皮和間充質標記因子的表達量變化。
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另外干細胞標志物在RUNX2、MTA1或CUL4B敲減后下調，在RUNX2、MTA1或CUL4B正常表達時上調，以及 細胞成球實驗和腫瘤生長實驗的結果都說明RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B可以促進癌細胞增殖。
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圖6. 細胞成球實驗結果表明RUNX2、NuRD(MTA1)和CRL4B都可以促進癌細胞增殖。
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RNA-seq 和KEGG分析結果表明，RUNX2和MTA1共同參與PI3K-AKT, HIF-1和 IL-17信號通路。qChIP分析顯示RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合物大量富集腫瘤抑制基因啟動子(SOD2、CASP7、PPARα、BAX、SIAH2、ANXAN7、FBAW7、EIF3F、EI24、TSC22D1、EGR1和NEURL1)。
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圖7. 使用CUT&Tag技術分析確定RUNX2和MTA1的基因組分布。
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圖 8. 3857個與RUNX2/MTA1/CUL4B復合物結合的啟動子（重疊區域）基因的KEGG通路分析
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圖9. qChIP結果表明SOD2、CASP7、PPARα 、SIAH2的基因啟動子和RUNX2、NuRD(MTA1)和CRL4B的富集度均較高。
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進一步的qChIP實驗表明，RUNX2、MTA1或CUL4B的敲減導致目標基因啟動子上相應蛋白的募集顯著減少。另外，在WB實驗中也得到了類似結果。綜上所述，這些結果證實了RUNX2、NuRD(MTA1)和CRL4B通過功能性結合來對多組抑癌靶基因(如PPARα、SOD2、CASP7和SIAH2)的轉錄進行抑制。
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圖10. qChIP結果表明SOD2、CASP7、PPARα 、SIAH2的基因啟動子豐度在RUNX2敲減后均有顯著降低。
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該部分實驗中應用了近岸蛋白的NovoNGS? CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit (for Illumina?)（Cat.No.:N259-YH01），首先使用CUT&Tag試劑盒對細胞樣本依次進行ConA磁珠結合、一抗和二抗結合、 pAG-Tn5結合、 加入Tagmentation buffer片段化DNA，DN**段純化后用于文庫構建和高通量測序。接著，通過qChIP實驗分析了RUNX2、MTA1或CUL4的結合位點，并成功確定了腫瘤抑制基因的富集啟動子。后續用qChIP實驗驗證了RUNX2、MTA1或CUL4敲減對啟動子富集的影響。
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該研究發現RUNX2的敲減促進了上皮標記因子的表達，降低了EMT標記因子的表達，而共同敲除PPARα或 SOD2可以部分恢復該表型，這表明RUNX2可以通過抑制PPARα或 SOD2的表達促進乳腺癌細胞的侵襲，同時，骨轉移相關標記因子表達的降低可以通過PPARα的共同敲減而得到恢復。這些結果表明RUNX2通過抑制PPARα和SOD2的表達促進乳腺癌細胞EMT和骨轉移。
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圖11和12. MDA-MB-231和SUM159細胞的趨化遷移試驗和癌細胞-骨基質粘附試驗都表明RUNX2通過抑制PPARα和SOD2的表達促進乳腺癌EMT和骨轉移。
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綜上所述，RUNX2在包括乳腺癌在內的多種癌癥中表達上調，而PPARα作為RUNX2的下游調節因子在乳腺癌中表達下調，提示RUNX2可能作為乳腺癌的生物標記因子。RUNX2可以與NuRD(MTA1)/CRL4B復合體合作，并且誘發癌細胞增殖、侵襲、骨轉移和癌干細胞特性。此外，RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合體有助于腫瘤抑制因子的表觀遺傳沉默。PPARα和SOD2被證實是RUNX2/NuRD(MTA1)/CRL4B復合體的靶基因。本研究為RUNX2在腫瘤發生和轉移中的作用提供了新的轉錄調控模型和新的分子基礎，表明RUNX2是一種潛在的治療手段癌癥治療的目標。
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在該項研究中使用的試劑盒NovoNGS? CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit (for Illumina?)（Cat.No.:N259-YH01）來自近岸蛋白。產品引用文獻已有10余篇，為研究蛋白與DNA互作提供了幫助，為整個研究奠定了基礎。
蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
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