為了系統地繪制癌癥發生過程中細胞狀態的空間動態，需要進行高分辨率的空間轉錄組學分析。Xenium In Situ和TF - seq FISH平臺已經成為兩個開創性的高通量分析平臺，用于在一個大的連續樣本中繪制數百到數千個RNA靶標的亞細胞定位。它們能夠以前所未有的單細胞分辨率對細胞結構和功能進行詳細的可視化和空間分析，因此是研究腫瘤空間進化的理想工具。食管鱗狀細胞癌( Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC )是進行這種癌變時空研究的理想模型系統。食管具有特征性的空間結構，由一層分層的食管上皮基底層組成，其中含有對上皮更新有反應的干細胞。在這里，我們應用Xenium In Situ和TF - seqFISH空間轉錄組學平臺，在食管組織切片上檢測了1，536個獨特的基因，并整合了單細胞RNA測序( scRNA-seq )數據，以系統地了解ESCC發展的連續階段。

scRNAseq ，Xenium，TF - seqFISH

高分辨率空間轉錄組整合：

1.結合 Xenium In Situ（300基因/640萬細胞/單細胞分辨率）和 TF-seqFISH（1,471基因/2.2萬細胞/亞細胞分辨率）平臺，首次實現食管鱗癌（ESCC）多階段連續演化的空間動態可視化。匹配 scRNA-seq（38.5萬細胞）數據，構建多層次細胞互作網絡。

2.跨尺度樣本設計：43例患者共127個視野（FOVs），覆蓋正常（NOR）、低/高級別上皮內瘤變（LGIN/HGIN）和浸潤癌（ESCC）階段。6例患者的多階段連續組織切片實現三維空間重構（如S1-1樣本含NOR→LGIN→HGIN→ESCC連續區域）。

1. 單細胞空間轉錄組學分析揭示了食管癌變過程中的動態細胞群

使用來自103 Genomics的Xenium In Situ平臺進行了空間轉錄組學分析，為300個基因(圖1A - 1C)在6，442，006個細胞中提供了單細胞分辨率分析。我們還將TF - seq FISH平臺應用于另外兩個包含NOR、LGIN和HGIN的組織玻片，在21，999個細胞上驗證和擴展了Xenium In Situ空間轉錄組學分析的結果，該分析檢測了Xenium In Situ鑒定的通路中的1，471個基因，此外，我們整合了來自143個多階段樣本的scRNA - seq數據，共包含385，151個細胞。這種綜合的方法使我們能夠在整個ESCC的發展過程中詳細地研究細胞狀態和細胞間的相互作用。

2. 上皮細胞演化驅動癌變

四大亞群動態轉換（Fig 2）：基底層細胞（Basal）：NOR階段表達去分化基因（NOTCH1, COL17A1）。

增殖細胞（Proliferative）：LGIN階段擴增（占比從7.2%→22.2%, *p*=9.7e-7），激活細胞周期/炎癥/DNA修復通路。侵襲細胞（Invasive）：HGIN階段出現（表達EMT基因MMP2/11、血管生成因子VEGFA/C），破壞上皮-間質界面（Fig 2C）。分化細胞（Differentiated）：隨著癌變比例驟減（NOR 86.7% → ESCC 4.8%）。去分化評分：基于43個食管特異性TF構建機器學習模型，證實侵襲細胞去分化程度接近基底層（Fig 3E）。

3. CAF-Epi生態位形成免疫豁免微環境

時空規律（Fig 4）：HGIN期：侵襲細胞通過JAG1-NOTCH1信號招募正常成纖維細胞（NFs）轉化為癌相關成纖維細胞（CAFs）。ESCC期：CAFs密度激增（NOR 0.12 → ESCC 5.77），與侵襲細胞共定位形成CAF-Epi生態位（腫瘤邊緣富集）。

機制驗證：空間鄰近性分析：距離侵襲細胞<10μm的成纖維細胞CAF轉化率最高（*p*<10??）（Fig 4E）。類器官共培養：ESCC細胞過表達JAG1 → 激活NFs遷移（*p*=1.2e?¹?）及CAF標記物（FAP/αSMA）上調。Notch1基因敲除小鼠：顯著減少ESCC病變（Fig 5F），證實Notch信號是CAF轉化的核心驅動。

3. 免疫微環境重塑

免疫抑制屏障形成（Fig 6）：CAF-Epi生態位誘導ECM重塑（膠原I/III沉積），在腫瘤邊緣形成物理屏障（250μm厚）。屏障內T細胞耗竭：CD8?效應T細胞密度下降（HGIN→ESCC, *p*=2.6e??），Tregs（*p*=3.9e??）和SPP1?巨噬細胞（*p*=4.0e?¹³）擴增。跨癌種保守性：在頭頸鱗癌（HNSC）中同樣觀察到CAF-Epi生態位及ECM屏障（Fig 6F-G）。

4. 臨床轉化價值評估

診斷標志物：侵襲性評分（19基因）和CAF評分（7基因）從HGIN期顯著升高（Fig 7B），可輔助病理分期。預后模型：CAF-Epi-免疫評分（26基因）在ESCC隊列（n=316）中預測生存（HR=1.74, *p*=2.4e??），且適用于HNSC/LUSC/CESC等鱗癌（Fig 7F-G）。治療靶點：靶向JAG1-NOTCH1-CXCL1/8軸可阻斷CAF轉化（小鼠模型驗證），或逆轉免疫抑制微環境。

本研究通過多階段空間轉錄組圖譜，揭示ESCC發生中上皮細胞去分化到間質浸潤到CAF生態位形成再到免疫豁免的級聯機制，為鱗癌早期干預提供新靶點（如JAG1-NOTCH1抑制劑），其構建的"CAF-Epi生態位"模型是理解實體瘤免疫逃逸的通用框架。技術局限與展望:基因覆蓋局限：Panel未覆蓋全轉錄組，可能遺漏稀有細胞亞群。CAF異質性：未區分myCAF/iCAF亞型（僅用FAP/αSMA標記）。動態追蹤：需類器官活體成像等技術解析生態位形成實時動態。

參考文獻：

Chang J, Lu J, Liu Q, Xiang T, Zhang S, Yi Y, Li D, Liu T, Liu Z, Chen X, Dong Z, Li C, Yi H, Yu S, Huang L, Qu F, Wang M, Wang D, Dong H, Cheng G, Zhu L, Li J, Li C, Wu P, Xie X, Teschendorff AE, Lin D, Wang X, Wu C. Single-cell multi-stage spatial evolutional map of esophageal carcinogenesis. Cancer Cell. 2025 Mar 10;43(3):380-397.e7. doi: 10.1016/j.ccell.2025.02.009. PMID: 40068596.