結直腸癌（Colorectal Cancer, CRC）是全世界最常見的癌癥之一。在過去的十年中，預防性篩查項目的推廣使死亡率大幅下降，然而在許多國家范圍內，結直腸癌仍然是癌癥相關死亡的第二大原因【1】。
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幾十年來，癌細胞系和基因編輯小鼠【2】一直是CRC研究的主要模型，人類腫瘤患者衍生異種移植(PDX)也已成為了CRC研究的工具【3】。與此同時，能夠在體外進行長期培養的原發性/轉移性CRC類器官模型進一步擴大了研究人員的選擇范圍。類器官既可以像PDX一樣代表了個體患者的真實腫瘤情況，又兼具了細胞系的可傳代、易于高通量篩選等特性。因此，CRC類器官模型正在廣泛應用于藥物研究、個性化醫療等領域。
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本篇文章基于Nature Chemical Biology【4】、STAR protocols【5】、Nature protocols【6】和Cell【7】發表的四篇文章，整理了人類結直腸癌組織來源的類器官培養方案。
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圖1. 病人組織來源的CRC類器官研究方案【8】
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細胞來源
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活檢樣本或手術樣本
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培養基配方
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組織處理
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1. 將新鮮CRC組織樣本放入預冷的PBS中，剔除脂肪組織和壞死的腫瘤組織（通常為黃色或白色），只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。
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2. 將CRC組織轉移到含有5 mL預冷的PBS溶液中清洗，去除血液和碎片。為防止污染，需要多次重復此步驟至液體變澄清。
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3. 吸出PBS，將組織切割為1-2 mm3的小塊，此步驟可以留存適量組織用于測序、免疫組化分析等。
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4. 將剩余組織塊切碎，并加入1 ml預冷的類器官培養基，用p1000吸頭將腫瘤碎片懸浮液轉移到含有5 ml解離培養基的離心管中，輕輕震蕩混勻后，放置于37℃培養箱中解離1 h。每隔15min輕輕震蕩或吹打混勻一次。
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5. 加入8ml 預冷的DMEM/F12（含10%FBS）終止消化。
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6. 將懸浮液經過70μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。
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7. 將過濾的細胞懸液在4℃條件下450g離心5min。
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8. 若細胞沉淀有明顯的紅色，則將細胞重懸于5ml的紅細胞裂解液中，冰上孵育10min使紅細胞裂解。
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9. 向細胞懸液中加入5ml DMEM/F12沖洗細胞一次，離心收集細胞沉淀后，加入1-2ml DMEM/F12重懸細胞，并進行臺盼藍染色和細胞計數。
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類器官培養
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10. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在冰上以3：1的體積比將Matrigel與細胞懸液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。
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11. 從37℃培養箱中取出預熱的24孔板，將80μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
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12. 將24孔板室溫放置5min后，轉移至37℃，5%CO2的培養箱中孵育10min，使Matrigel固化。
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13. 向每個孔中緩慢滴加650μl 預熱的類器官培養基，確?；|膠被完全覆蓋。放于37℃，5%CO2的培養箱中培養，每2-3天更換培養基（用于換液的類器官培養基內不含Y27632)。
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類器官傳代
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14. 吸出類器官培養液，機械分離Matrigel，然后加入500μl胰蛋白酶，放置于37℃培養箱中孵育1-2min后，用移液器多次吹打，從基質膠中釋放類器官。
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15. 用含有10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，在4℃條件下300g離心5min。
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16. 用冷PBS清洗后，再次4℃條件下300g離心5min。
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17. 將所得沉淀按照1:3-1:5的比例重復10-13步驟（具體比例通過類器官的匯合度確定），完成傳代。
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類器官凍存
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18. 取1-2個孔的類器官，消化離心后取細胞沉淀，加入1ml細胞凍存液。
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19. 將細胞重懸后轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。
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20. 第二天，將樣品轉移到液氮中長期儲存。
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類器官復蘇
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21. 將液氮凍存的CRC類器官放置在37℃水浴鍋中進行解凍，水浴時間不宜超過2min。
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22. 將細胞懸液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM/F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下300g離心5min，取細胞沉淀。
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23. 將所得沉淀重復10-13步驟，完成CRC類器官復蘇。
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圖2. 顯微鏡下CRC類器官的形態，以及Ki-67、E-Cadherin標記物的表達【5】
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利用類器官技術，能夠將CRC和正常結直腸組織在體外進行長期擴增，并且在微衛星穩定（MSS）來源的CRC類器官中發現，類器官模型能夠保留樣本的遺傳多樣性和形態穩定性【9】。結直腸（癌）類器官的進一步優勢包括可以進行建庫、細胞異質性研究、實驗動物移植、個體患者分析和基因編輯，目前已經成為了疾病建模的優秀工具，未來可能在再生醫學領域大放異彩【10】。
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圖3. 結直腸（癌）類器官在基礎和臨床研究中的應用【10】
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近岸蛋白自主研發生產的低內毒素Activin A、FGF系列、HGF、R-Spondin 1、Noggin和Wnt3a等細胞因子，內毒素低至＜10EU/mg，具有高活性、高純度、高批間一致性，為類器官培養設計，已獲得市場認可，讓您研究放心！
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Human EGF |
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Mouse EGF (C-6His) |
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Human FGF basic/FGF-2 |
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Human Noggin |
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Mouse Noggin(C-6His) |
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Human R-Spondin 1 (C-6His) |
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Human/Mouse/Rat Activin A |
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Human/Mouse/Rat BDNF |
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Human/Mouse/Rat BMP-2 |
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Human DKK1 (N-8His) |
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Human FGF-4 |
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Mouse FGF-4 |
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Human FGF-7/KGF |
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Human FGF-9 |
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Mouse FGF-9 (N-6His) |
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Human FGF-10 |
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Human FGF-19 (N-6His) |
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Human GDNF |
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Human HGF (C-6His) |
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Mouse HGF (C-6His) |
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Human LR3 IGF-I |
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Mouse LR3-IGF-1 (C-6His) |
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Human LIF |
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Mouse LIF |
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Human NT-3 |
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Human NRG1-beta 1 |
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Human OSM (N-6His) |
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Human Prolactin/PRL |
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Human R-spondin 3 (C-6His) |
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Human Shh |
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Human Shh (C24II) |
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Mouse Shh |
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Mouse Shh(C25II) |
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Human TGF-beta 1 |
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Human Wnt3a |
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Human Wnt3a V2 |
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類器官培養交流群
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參考文獻
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【1】TORRE, Lindsey A., et al. Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians, 2015, 65.2: 87-108.
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【2】EVANS, Jonathan P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Critical reviews in oncology/hematology, 2016, 98: 94-105.
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【3】BROWN, Kai M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget, 2016, 7.40: 66212.
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【4】TOSHIMITSU, Kohta, et al. Organoid screening reveals epigenetic vulnerabilities in human colorectal cancer. Nature Chemical Biology, 2022, 18.6: 605-614.
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【5】BERGIN, Christopher J., et al. Protocol for serial organoid formation assay using primary colorectal cancer tissues to evaluate cancer stem cell activity. STAR protocols, 2022, 3.1: 101218.
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【6】FUMAGALLI, Arianna, et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature protocols, 2018, 13.2: 235-247.
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【7】VAN DE WETERING, Marc, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 2015, 161.4: 933-945.
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【8】SASAKI, Nobuo, et al. Studying cellular heterogeneity and drug sensitivity in colorectal cancer using organoid technology. Current Opinion in Genetics & Development, 2018, 52: 117-122.
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【9】BEHJATI, Sam, et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature, 2014, 513.7518: 422-425.
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【10】BARBáCHANO, Antonio, et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers, 2021, 13.11: 2657.
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蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
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