樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞（APC），一個DC能夠激活100-3000個T細胞，是巨噬細胞和B細胞的100-1000倍。DC通過處理腫瘤抗原并將其遞呈給T細胞，能顯著刺激初始T細胞增殖的APC，其他種類的APC（如巨噬細胞、B細胞）僅能刺激已活化或記憶T細胞。
目前DC體外培養主要是用細胞因子從骨髓、外周血和臍帶血的DC前體定向誘導。骨髓和臍帶血取樣困難，外周血由于取材簡單，不需要復雜的篩選和純化過程，是目前臨床獲得DC的較好途徑。
DC細胞治療流程
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細胞來源：患者外周血CD14+單核細胞、CD34+造血祖細胞； -
體外分化：使用GM-CSF和IL-4誘導CD14+單核分化為未成熟MoDC； -
抗原負載與成熟：負載腫瘤抗原如腫瘤特異性抗原肽（TSA）、腫瘤相關抗原（TAA）、腫瘤裂解物或預定抗原如蛋白或mRNA形式； -
誘導成熟：通過TNF-α+IL-1β+IL-6+PGE2因子組合誘導DC成熟； -
回輸治療：將成熟DC回輸患者，可結合免疫檢查點抑制劑（如PD-1）抗體增強療效。
圖1 ：傳統DC疫苗流程和新型優化策略示意圖[1]
細胞因子的誘導機制
GM-CSF+IL-4：促進單核細胞向＂大巨噬樣細胞＂分化；IL-4抑制DC前體向CD14+巨噬細胞分化，而分化為CD14-/CD1a-的iDC；
GM-CSF和IL4共同作用使單核細胞定向分化為iDC，此時的iDC具有較強的抗原攝取和加工能力，遞呈能力很弱，細胞表面低中度表達MHCⅠ、Ⅱ類分子和B7家族分子（CD80、CD86等），但不表達或低表達CD14。
TNF-α+IL-1β：TNF-α激活NF-κB 信號通路，促進DC成熟（CD1a+/CD83+)，IL-1β與TNF-α協同，強化DC成熟；TNF-α 和 IL-1β 主導 MHCⅡ類分子/共刺激分子表達
IL-6+PGE2：IL-6激活STAT3信號通路，PGE2是炎性介質，PGE2 和 IL-6可進一步提高DC的產量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力，尤為重要的是DC遷移能力。
這一階段mDC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強地激活T細胞
圖2 ：細胞因子誘導外周血CD14+單核細胞生成DC[2]
DC誘導培養實驗流程[3，4，5，6]
01 外周血單核細胞收集
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全血采集處理，Ficoll梯度離心法從全血中獲得人外周血單個核細胞（PBMC）；
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貼壁法或磁珠法進行CD14+單核細胞富集。
貼壁法：2×106 cells/ml鋪板PBMC，37℃培養1-2h使單核細胞貼壁，搖動培養板使非貼壁細胞松動并吸出
磁珠法：CD14+磁珠陽性分選，獲得高純度單核細胞
注意：PBMC中含有單核細胞和淋巴細胞，這一步目的是去除懸浮的淋巴細胞
02 DC細胞的培養
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將單核細胞以1.5×106cells/ml密度鋪至24孔板，加入含GM-CSF（100ng/ml）和IL4（50ng/ml）的完全培養基，培養箱培養2 天； -
第3天，進行半量換液，收集培養基到離心管，450g 4min離心，留上清，加入細胞培養板，再加入含GM-CSF和IL4的等體積新鮮培養基，培養箱培養2天；
注意：這一階段貼壁的細胞會輕輕浮起來，是常見的半懸浮的DC。
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第5天，輕輕吹打培養基，收獲懸浮細胞和松散貼壁細胞，1000r 離心 5min，棄上清，收獲未成熟的MoDC；
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新鮮培養基重懸細胞，并加入TNF-α（10ng/ml）、IL-1β（10ng/ml）、IL-6（100ng/ml）和PEG2（1ug/ml），培養箱培養2-4天； -
第7-8天，多次吸液和排液松動貼壁不牢固的細胞，450g 4min離心收獲成熟DC。
DC培養鑒定
01 形態學鑒定
5d后iDC細胞松散貼壁，外形不規則，有少許刺狀突起，8d后典型是mDC，懸浮細胞增多，體積變大，大量細刺狀突起。
02 流式細胞術
CD14（單核細胞特異性maker）、HLA-DR（人類白細胞抗原中的Ⅱ類分子）、CD1a/CD83（成熟DC特異性標志）、CD40/80/86（共刺激分子）、DC-SIGN（樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子，參與捕獲抗原）等分子的流式細胞檢測方法通常用于分析樹突狀細胞的成熟狀態及其功能特征。
03 細胞因子檢測
人DC除了IL-6、TNF-α和MCP-1外，還常檢測IL-12p70、IL-10和IL-1β，這些細胞因子更能全面反映人DC的免疫調節功能，小鼠DC檢測的IL-6、TNF-α和MCP-1，更多反映其炎癥反應和趨化能力。
04 混合淋巴反應（MLR）
MLR是基于DC能夠激活T淋巴細胞引發免疫反應的原理，通過檢測T細胞的增殖等反應來評估免疫應答強度。
近岸蛋白可提供DC體外誘導培養所需的科研級和GMP級細胞因子，高活性、低內毒素、高批間一致性，包含GM-CSF、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-1β等，助力DC細胞的高效、穩定、合規培養。
高活性：細胞活性檢測
Measured in a cell proliferation assay using TF1 human erythroleukemic cells.The specific activity of recombinant human GM-CSF is ≥1.0 x 107 IU/mg, which is calibrated against the human GM-CSF Standard (NIBSC code: 88/646).
高批間一致性：確保實驗可重復性
Measured in a cell proliferation assay using TF1 human erythroleukemic cells.The specific activity of recombinant human GM-CSF is ≥1.0 x 107IU/mg,Three independent lots were tested for activity and plotted on the same graph to show lot-to-lot consistency of GM-CSF.
DC培養相關產品
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DC-CIK培養相關產品
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DC 細胞生長擴增 |
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CIK激活擴增 |
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CIK 激活擴增，含 Anti-CD3、NovoNectin 等 |
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CIK生長擴增 |
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CIK生長擴增 |
參考文獻
[1]Perez, Caleb R, and Michele De Palma. “Engineering dendritic cell vaccines to improve cancer immunotherapy.” Nature communications vol. 10,1 5408. 27 Nov. 2019, doi:10.1038/s41467-019-13368-
[2]Chung, N P-Y et al. “Dendritic cells: sentinels against pathogens.” Histology and histopathology vol. 19,1 (2004): 317-24. doi:10.14670/HH-19.317
[3]Jonuleit, H et al. “Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.” European journal of immunology vol. 27,12 (1997): 3135-42. doi:10.1002/eji.1830271209
[4]Gieseler, R et al. “In-vitro differentiation of mature dendritic cells from human blood monocytes.” Developmental immunology vol. 6,1-2 (1998): 25-39. doi:10.1155/1998/72054.
[5]陸小鵬，等. "人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞的體外‘2+2’快速法培養及其鑒定." 動物學研究, vol. 29, no. 4, 2008, pp. 415-420. DOI:10.3724/SP.J.1141.2008.04415.
[6]Figueroa, Gloria et al. “Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols.” Journal of visualized experiments : JoVE ,116 54296. 18 Oct. 2016, doi:10.3791/54296.