外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）是從外周血中分離的淋巴細胞和單核細胞的總稱，存在于骨髓中的造血干細胞（HSC），包括70%-90%的淋巴細胞（T細胞、B細胞和NK細胞），而T淋巴細胞的活化，在免疫應答中扮演著相當重要的角色。

細胞因子γ鏈共受體家族包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，它們在T細胞分化、增殖和內環境穩定中起著關鍵作用。他們受體包括共同的γ鏈（γc）和一個各自單獨的受體鏈，下游信號激活STAT信號通路。在PBMC來源T細胞擴增和培養中最常用的細胞因子為IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，可以促進T細胞克隆擴增，并可分化為效應細胞和記憶性T細胞^[1]。

圖1 細胞因子信號通路^[1]

（1）使用肝素抗凝采血管收集外周血樣本，將血液樣本與RPMI1640按照1：1緩慢稀釋^[2]；

（2）在15ml或50ml離心管中加入適量的Ficoll-Paque密度梯度介質；

（3）小心地將稀釋后的血液緩慢加在Ficoll層上，確保界面清晰；

（4）在室溫下400g離心30分鐘，PBMC會形成一個清晰的環狀帶（白膜層），位于Ficoll層的上方；

（5）用滴管小心吸取白膜層細胞，轉移到新的離心管中；

（6）加入5倍以上體積的PBS或RPMI1640，以250g離心10分鐘，重復兩次；

   注意：盡可能去除殘余血小板；

（7）棄上清，用含有10%胎牛血清的RPMI1640重懸細胞，濃度為10⁶cells/ml。根據實驗需要可選擇2-3×10⁵/ml~10⁶/ml的濃度。

（1）抗體法

1. 將CD3抗體和CD28抗體按比例混合，溶于400μl無菌PBS中，充分混勻?？贵w濃度為5-10μg/ml的anti-CD3抗體(Cat. No.:GMP-A018)、5-10μg/ml的anti-CD28抗體(Cat. No.:GMP-A063)。

2. 在24孔板中，每孔加入400μl抗體混合液，空白對照孔加400μl無菌PBS；

   注：24孔板在加入抗體混合液之前先用無菌PBS潤洗2-3遍，避免干孔。

3. 用封口膜封好，37℃孵育2小時或4℃過夜；

4. 加細胞前，吸棄孔內殘余溶液，用200μl無菌PBS洗兩次，去除未結合抗體；

5. 洗板結束后，每孔加500μl細胞懸液，每樣本可重復3個孔；

6. 細胞培養

   方案一：細胞稀釋成2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔，以含10%FBS，100ng/mL的IL-2的RPMI-1640完全培養基培養（37℃，5%CO₂）^[3,4]；

   方案二：將細胞稀釋至2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔。以含10%FBS，10ng/mL的IL-7、IL-15的RPMI-1640完全培養基培養（37℃，5%CO₂）^[5,6]。

   方案三：細胞稀釋至2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔。以含10%FBS，25ng/mL的IL-7、IL-15和IL21的RPMI-1640完全培養基培養（37℃，5%CO₂）^[7,8]。

   注意：高濃度（如25ng/ml）的IL-7、IL-15和IL-21適用于需要快速擴增和增強T細胞功能的場景，而低濃度（如10ng/ml）的IL-7和IL-15則更適合維持T細胞的長期穩定性和記憶細胞特性。

（2）磁珠法

1. 磁珠清洗:將 anti-Human CD3/CD28 Beads(Cat. No.:GMP-B016)磁珠重懸后，取適量的磁珠到新的無菌 EP 管中，加入 1mL PBS (pH7.4)重懸，混合 3-5min，置于磁力架上分離磁珠 1min，去掉上清，加細胞培養基重懸待用；

2. 細胞激活:將洗好的磁珠加入到已分離的PBMC細胞中，重懸到1-2×10⁶cells/mL確保按照下表推薦用量添加磁珠，并添加IL-2(Cat. No.:C013)，置于37℃，5%CO₂培養箱培養；

   

   注意：添加IL-2，建議使用濃度為100ng/mL，可根據實際反應體系進行調整及優化。

3. 細胞擴增:細胞密度超過2.5×10⁶cells/mL或者培養基變黃時，將細胞轉移到更大的培養器皿中并用新的含有IL-2的培養基稀釋到0.5-1×10⁶cells/mL，并記錄細胞活率及擴增倍數，培養14-21天后收集細胞;

   注意：利用磁珠法體外擴增和培養T細胞的過程與抗體法類似。利用磁珠培養得到的細胞若想要上流式，需要在染色前將磁珠除去，將含有細胞的管子置于磁力架上1-2min，然后將含有細胞的上層液體轉移至新的管子中即可分離磁珠。

（1）擴增倍數：分別于培養第0天、第7天、第14天、第21天對細胞進行計數，計算細胞擴增倍數，評估T細胞的擴增能力。

（2）凋亡水平：使用PI染料通過流式細胞術檢測細胞活死比例，衡量凋亡水平，或使用臺盼藍染色測定細胞活死比例；

（3）亞群分析：分別于培養第0天、第7天、第14天、第21天通過流式細胞術分析細胞CD45RA和CD62L表達情況，判定T細胞亞群。其中：Tn細胞(CD45RA+CD62L+)，Tcm細胞(CD45RA-CD62L+)，Tem細胞(CD45RA-CD62L-)和Teff細胞(CD45RA+CD62L-)^[8]。

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Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti-Human CD3/CD28 Beads (Cat. No.:GMP-B016) , and expanded with human IL-2 (Cat. No.:C013) for 14 days.(Data were kindly provided by Novoprotein's customer. Thanks for her contribution)

Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti-Human CD3/CD28 Beads (Cat. No.:GMP-B016) , and expanded with human IL-2 (Cat. No.:GMP-C013) for 14 days.