多年來，T7 RNAP已廣泛應(yīng)用于原核生物和真核生物中的高水平基因表達(dá)，并在生物學(xué)其他領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛擴(kuò)展，例如RNA干擾、RNA編輯、合成基因電路、構(gòu)建Vaccinia / T7混合系統(tǒng)等。
圖1: T7 RNAP 在生物領(lǐng)域的多方面作用[1]
雖然T7 RNAP得到了廣泛應(yīng)用，但是，其作為體外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺點(diǎn)。T7 RNAP在合成RNA的過程中可能會(huì)產(chǎn)生許多的副產(chǎn)物，包括轉(zhuǎn)錄起始過程中產(chǎn)生的寡核苷酸、終止信號(hào)造成的中斷RNA產(chǎn)物、依賴RNA的RNA聚合酶活性造成的3’末端延伸產(chǎn)物等。
因而，急需優(yōu)化改進(jìn)T7 RNAP，使其不僅能維持高效轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也能夠減少RNA產(chǎn)物不均一的問題。現(xiàn)在專利主要集中在以下方面: 通過改變特定位點(diǎn)氨基酸，提高T7 RNAP突變體的熱穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄活力；通過提高轉(zhuǎn)錄溫度，可以有效減少dsRNA的產(chǎn)生，但轉(zhuǎn)錄溫度的提高同時(shí)，對(duì)生產(chǎn)工藝也提出了更高的要求；或通過定點(diǎn)突變T7 RNA聚合酶核苷酸序列增加酶的穩(wěn)定性等。
基于T7 RNAP突變體的研究還在不斷推陳出新。近岸蛋白推出新一代專利產(chǎn)品“T7 RNA聚合酶突變體”（專利號(hào)：ZL 2021 1 0044261.3，產(chǎn)品目錄號(hào)：GMP-E122），經(jīng)過上百個(gè)模板的驗(yàn)證，dsRNA產(chǎn)物在大多數(shù)模板上低于0.1ng/μg，在修飾核苷模板上更是可以低于0.01ng/μg，相較于常規(guī)T7 RNA聚合酶，數(shù)量級(jí)降低dsRNA含量。
圖2：突變T7酶大幅降低dsRNA含量
在過往的突變體中，往往強(qiáng)調(diào)了某一方面的性能，卻伴隨著其他性能的減弱。近岸蛋白新一代T7 RNAP突變體除顯著降低dsRNA含量外，搭配特別優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液（產(chǎn)品目錄號(hào)：GMP-EB001），從產(chǎn)量（1μg模板可獲得超過200μg RNA），到完整性（在不同質(zhì)量模板下，完整性均可提高5-10%）以及加帽率（95-100%）等均維持較高的水平，屬全能型選手。
圖3：數(shù)據(jù)展示
同時(shí)，隨著自復(fù)制mRNA的研究越來越熱，對(duì)于長片段轉(zhuǎn)錄的需求也越來越緊迫，傳統(tǒng)T7 RNAP在長片段轉(zhuǎn)錄方面存在不可忽視的欠缺（完整性差、dsRNA含量高等）。
近岸蛋白新一代T7 RNA聚合酶突變體在自復(fù)制模板上同樣展現(xiàn)出優(yōu)異的性能。
圖4：自復(fù)制saRNA完整性高
今年2月，Trilink帽結(jié)構(gòu)專利在國內(nèi)獲批，本來成本占比就比較高的前提下，加之專利授權(quán)費(fèi)用，雙重壓力下，無疑給mRNA藥物研發(fā)及生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的沖擊。那么此時(shí)減少帽結(jié)構(gòu)的用量無疑成為降低研發(fā)及生產(chǎn)成本的有效措施。為此，近岸蛋白特別設(shè)置從0.5mM-6mM帽結(jié)構(gòu)投入量，分別搭載常規(guī)T7 RNA聚合酶和新一代T7 RNAP突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，結(jié)果顯示，帽結(jié)構(gòu)使用量可以低至1mM，新一代T7 RNAP突變體在各個(gè)方面均表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。
經(jīng)過多種模板驗(yàn)證，近岸蛋白推出系列適合不同體系轉(zhuǎn)錄試劑盒，助力核酸藥物快速開發(fā)：
| 貨號(hào) | 品名 | 描述 |
| E331 | T7 High Yield RNA Co-Transcription Kit for Reducing dsRNA Content | 低dsRNA共轉(zhuǎn)錄試劑盒（含N1-Me-pUTP修飾堿基） |
| E332 | T7 High Yield RNA Transcription Kit 2.0 | 低dsRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒 |
| E334 | T7 High Yield RNA Transcription Kit 2.0（N1-Me-pUTP） | 低dsRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（含N1-Me-pUTP修飾堿基） |
| E341 | T7 High Yield RNA Transcription Kit for Long Fragment | 適合大于6K以上長片段轉(zhuǎn)錄試劑盒 |
更多相關(guān)產(chǎn)品
[1] Borkotoky Subhomoi,Murali Ayaluru,The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm.[J] .Int J Biol Macromol, 2018, 118: 49-56.