多年來,T7 RNAP已廣泛應用于原核生物和真核生物中的高水平基因表達,并在生物學其他領域的應用得到廣泛擴展,例如RNA干擾、RNA編輯、合成基因電路、構建Vaccinia / T7混合系統等。

圖1: T7 RNAP 在生物領域的多方面作用[1]
雖然T7 RNAP得到了廣泛應用,但是,其作為體外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺點。T7 RNAP在合成RNA的過程中可能會產生許多的副產物,包括轉錄起始過程中產生的寡核苷酸、終止信號造成的中斷RNA產物、依賴RNA的RNA聚合酶活性造成的3’末端延伸產物等。
因而,急需優化改進T7 RNAP,使其不僅能維持高效轉錄,同時也能夠減少RNA產物不均一的問題。現在專利主要集中在以下方面: 通過改變特定位點氨基酸,提高T7 RNAP突變體的熱穩定性或轉錄活力;通過提高轉錄溫度,可以有效減少dsRNA的產生,但轉錄溫度的提高同時,對生產工藝也提出了更高的要求;或通過定點突變T7 RNA聚合酶核苷酸序列增加酶的穩定性等。
基于T7 RNAP突變體的研究還在不斷推陳出新。近岸蛋白推出新一代專利產品“T7 RNA聚合酶突變體”(專利號:ZL 2021 1 0044261.3,產品目錄號:GMP-E122),經過上百個模板的驗證,dsRNA產物在大多數模板上低于0.1ng/μg,在修飾核苷模板上更是可以低于0.01ng/μg,相較于常規T7 RNA聚合酶,數量級降低dsRNA含量。

圖2:突變T7酶大幅降低dsRNA含量
在過往的突變體中,往往強調了某一方面的性能,卻伴隨著其他性能的減弱。近岸蛋白新一代T7 RNAP突變體除顯著降低dsRNA含量外,搭配特別優化的反應緩沖液(產品目錄號:GMP-EB001),從產量(1μg模板可獲得超過200μg RNA),到完整性(在不同質量模板下,完整性均可提高5-10%)以及加帽率(95-100%)等均維持較高的水平,屬全能型選手。

圖3:數據展示
同時,隨著自復制mRNA的研究越來越熱,對于長片段轉錄的需求也越來越緊迫,傳統T7 RNAP在長片段轉錄方面存在不可忽視的欠缺(完整性差、dsRNA含量高等)。
近岸蛋白新一代T7 RNA聚合酶突變體在自復制模板上同樣展現出優異的性能。

圖4:自復制saRNA完整性高
今年2月,Trilink帽結構專利在國內獲批,本來成本占比就比較高的前提下,加之專利授權費用,雙重壓力下,無疑給mRNA藥物研發及生產企業帶來巨大的沖擊。那么此時減少帽結構的用量無疑成為降低研發及生產成本的有效措施。為此,近岸蛋白特別設置從0.5mM-6mM帽結構投入量,分別搭載常規T7 RNA聚合酶和新一代T7 RNAP突變體進行轉錄反應,結果顯示,帽結構使用量可以低至1mM,新一代T7 RNAP突變體在各個方面均表現出了優異的性能。

經過多種模板驗證,近岸蛋白推出系列適合不同體系轉錄試劑盒,助力核酸藥物快速開發:
| 貨號 | 品名 | 描述 |
| E331 | T7 High Yield RNA Co-Transcription Kit for Reducing dsRNA Content | 低dsRNA共轉錄試劑盒(含N1-Me-pUTP修飾堿基) |
| E332 | T7 High Yield RNA Transcription Kit 2.0 | 低dsRNA轉錄試劑盒 |
| E334 | T7 High Yield RNA Transcription Kit 2.0(N1-Me-pUTP) | 低dsRNA轉錄試劑盒(含N1-Me-pUTP修飾堿基) |
| E341 | T7 High Yield RNA Transcription Kit for Long Fragment | 適合大于6K以上長片段轉錄試劑盒 |
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[1] Borkotoky Subhomoi,Murali Ayaluru,The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm.[J] .Int J Biol Macromol, 2018, 118: 49-56.
