腫瘤細胞在重編程代謝方面具有極高的靈活性，以推動腫瘤的發生、進展、轉移和對治療的抵抗。這些重編程的活動包括對細胞生物能、生物合成和氧化還原狀態的全面重構，以滿足細胞的能量需求增加。代謝組學和代謝流組學（fluxomics）是主要革命性技術方法，使研究人員能夠對癌癥中的生化活動進行定性檢測和機制分析。此外，從大規模分析轉向單細胞分析技術提供了前所未有的機會：對癌癥生物學指標進行深入的定量分析，實現對復雜和異質性疾病的研究。
近期，功能基因組篩選的出現使得識別分子通路、細胞過程、生物標志物和新的治療靶點成為可能，這與其他技術結合起來可以實現患者分層和治療方案的個性化。本綜述旨在為研究人員提供癌癥代謝方面的指南，突出當前的新興技術，強調其優點、缺點和應用，并有潛力推動創新抗癌治療的發展。
癌癥代謝的研究進展
1910年，Joseph J. Thomson首次測量了分子的質譜圖。1931年，Otto H. Warburg因為對呼吸酶的表征而獲得了諾貝爾醫學獎。1938年，Isidor I. Rabi首次在氯化鋰束流中檢測到核磁共振（NMR），從而發展了該方法，并在1946年由Felix Bloch和Edward M. Purcell擴展到液體和固體。氣相色譜-質譜（GC-MS）于1959年出現，液相色譜-質譜（LC-MS）于1974年引入。癌基因和腫瘤抑制基因的發現可以追溯到20世紀80年代。1994年，Tsutomu Nomizu和他的同事首次實現了單細胞質譜實驗檢測，而在1998年，Steven Oliver首次引入了代謝組學的概念。2004年出現了下一代測序（NGS）技術，2007年誕生了飛行時間細胞流式細胞儀（CyTOF）的首個原型和人類代謝組數據庫（HMDB）的第一個版本。2009年發展出了單細胞RNA測序（scRNAseq），2016年發展出了單細胞代謝組學（SCM），2017年發展出了空間代謝組學。2014年進行了首次全基因組功能篩選，2020年Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因發現CRISPR/Cas9系統而獲得諾貝爾化學獎。2020年，基于流式細胞術的Met-flow和SCENITH技術被提出。2022年，Douglas Hanahan最終將細胞代謝的失調認定為癌癥的核心特征。
圖1. 癌癥代謝研究的重要事件時間線
代謝組學：癌癥研究和治療的強大工具
代謝組學是對小分子代謝物的高通量研究，包括細胞、生物體液、組織等基質中具有不同生理化學特征和動態豐度范圍的所有小分子(50?1500Da)，通常稱為代謝物。鑒定與其他組學檢測不同，代謝物及其濃度直接代表分子表型。代謝組學用于癌癥研究，以有效檢測生物樣品中其水平受腫瘤進展影響的代謝物，具有廣泛的應用，如生物標志物篩選鑒定、藥物發現或開發、臨床毒理學、營養研究和定量表型分析。
代謝組學有兩種檢測策略：靶向或非靶向分析。靶向（或基于驗證）代謝組學方法的目標是識別和量化相對較少（＜100）的已知分析物，而非靶向（或基于發現）代謝組學用于更全?的分析和代謝物的相對定性和定量。靶向方法具有準確定性定量測定目標物質的優點，但它的局限性在于部分代謝組學覆蓋，有可能遺漏其他類別的代謝物導致目標代謝通路的不完整。非靶向代謝組學方法的分析雖然不需要任何預先存在的知識或假設，覆蓋的代謝物種類更全面，但因其鑒定參照往往來自于商業庫，或受到生物樣本基質效應的影響，導致其定性和定量的準確性不能得到有效保證。
代謝組學樣品制備包括代謝淬滅和代謝物提取。代謝物需要通過氣相色譜（GC）、液相色譜（LC）、毛細管電泳（CE）進行分離，或者可以直接在直接進樣（DI）和質譜成像（MSI）中進行離子化?？梢允褂貌煌碾x子化技術：電子碰撞離子化（EI）、化學離子化（CI）、大氣壓化學離子化（APCI）、電噴霧離子化（ESI）、基質輔助激光解吸離子化（MALDI）?？梢赃x擇單一（MS）或串聯（MS/MS）質量分析儀器來根據離子的m/z值進行分離：四極桿（Q）、四極離子阱（QIT）、飛行時間分析儀（TOF）、傅里葉變換離子回旋共振（FTICR）、軌道阱（OT）。數據處理包括m/z值的轉換、基線過濾、歸一化和鑒定等。
圖2. 基于質譜（MS）的代謝組學工作流程
代謝流分析（metabolic flux analysis, MFA）
代謝組學是一種可靠的技術，能夠識別與腫瘤相關的代謝特征；但往往無法揭示代謝通路的可塑性和動態性，僅提供了癌細胞代謝的靜態快照。代謝流分析（MFA）利用穩定同位素標記的底物可以通過追蹤下游代謝產物中特定原子的同位素富集情況來確定通量速率，從而真正連接組學分析和表型（圖3）。如圖3所示，第一步是設計實驗，包括通過計算模擬確定最佳示蹤劑以獲得最高通量分辨率和底物標記。在穩定同位素示蹤劑的給予后，樣品會被分析其同位素標記和外部速率，外部速率考慮了底物的吸收和產物的分泌。代謝物的標記可以通過質譜（MS）或核磁共振（NMR）來測量，并整合到代謝網絡模型中，標記測量要適應模型，并包括所有相關反應及其相應的碳原子轉換。
圖3. 代謝流分析（MFA）的實驗工作流程
細胞外通量分析（extracellular flux analysis, EFA）
細胞外通量分析（EFA）是利用Agilent Seahorse XF分析儀作為**技術的一種方法。它是廣泛定量活細胞、器官樣或組織的生物能活性的最常用和可行的方法（圖4）。簡而言之，EFA通過定量測量線粒體電子傳遞速率（被稱為線粒體氧化磷酸化作用）的氧消耗速率（OCR），以及通過乳酸生成的細胞外酸化速率（ECAR）來衡量糖酵解的結果。該儀器通過從微孔板中的細胞單層中取少量培養基（僅幾微升）實時測量OCR和ECAR。兩個安裝在光纖探針中的傳感器用于在幾分鐘內定量測量氧氣水平和培養基pH值，然后軟件外推OCR（pmol/min）和ECAR（mpH/min）的定量結果。
關鍵的代謝途徑控制著癌細胞的生長，可以通過EFA進行檢測。（圖4）通過連續注射葡萄糖、奧利司他霉素和2-脫氧葡萄糖（2-DG）進行糖酵解應激試驗，以獲取糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備和非糖酵解酸化測量的結果。ECAR代表細胞外酸化速率。糖酵解速率試驗報告了多個關鍵參數，如基礎糖酵解、通過羅特儂和抗霉素A抑制線粒體呼吸而實現的代償性糖酵解。質子外流速率（PER）是糖酵解過程中排出細胞外介質的質子的定量測量。細胞線粒體壓力試驗通過定量測量氧氣消耗速率（OCR）來測量線粒體呼吸。細胞依次接觸奧利司他霉素、4-(三氟甲氧基)苯基腙*和羅特儂和抗霉素A，從而測量基礎呼吸、最大呼吸和呼吸潛力（spare respiratory capacity）。底物氧化壓力試驗通過與標準的細胞線粒體壓力試驗結合使用特定抑制劑來測量長鏈脂肪酸（LCFAs）、葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺作為主要底物對線粒體代謝的貢獻。
圖4. 通過細胞外通量分析 (EFA)檢測的控制癌細胞生長的關鍵代謝途徑
單細胞代謝分析（Single-cell metabolic analysis, SMA）
截至目前，關于癌癥代謝的大多數研究結果是通過細胞培養模型和從體內獲取的腫瘤樣本中檢測獲得的。代謝組學和EFA分析的一個最大限制是它們不能同時進行代謝狀態和表型分析。每個細胞的結果都受到遺傳和環境因素的影響，因此與細胞種群的異質性很難兼容。此外，標準細胞培養基與人體生理營養環境并不相似，腫瘤微環境中的營養物可用性明顯調節代謝依賴性。單細胞測序scRNAseq的出現為以高分辨率檢測腫瘤的基因組特征提供了前所未有的機會。檢測代謝基因表達變化是擴展對癌癥代謝重組的理解和識別代謝特征的有力工具。通過微流控裝置將收集在亞微升級液滴中的單個細胞分選到多孔板上；在細胞溶解后，通過條形碼對細胞進行編碼，以將測序數據分配給每個細胞（圖5）。這一技術進步得益于能夠捕獲和測序極少量的RNA。scRNAseq研究顯示，惡性細胞普遍上調幾乎所有功能類別的代謝途徑相關基因，表明其具有高度的代謝可塑性，使其能夠適應不同的遺傳和環境因素。代謝基因的整體轉錄重組表明，癌細胞為這些基因的表達保留了更多的轉錄資源，從而增加了大多數代謝反應的通量。
單細胞代謝組學(SCM)提供了生物系統中細胞代謝的所有代謝物、中間體和最終產物的快照，解碼細胞內的生化異質性。制備單細胞樣品的最大挑戰是避免或至少減少樣品處理對細胞代謝的影響。單細胞樣品制備的標準方法是熒光活化細胞分選(FACS)和微流體陣列，保持完整的細胞形態或通過原子力顯微鏡(AFM)探針提取，探針中只保留細胞的代謝物。細胞代謝應被淬滅，并可通過基于質譜的技術進行分析(圖5b)。先前針對單細胞水平代謝基因的基因組分析表明，個體惡性細胞具有在大量腫瘤研究中未觀察到的代謝活性升高和變異。相對于scRNAseq，SCM有助于解剖細胞異質性，因而在腫瘤疾病和轉移檢測、精確藥物設計、藥物評估和毒性方面尤其有用。此外，SCM還可用于分析罕見或循環腫瘤細胞(ctc)以及癌癥亞型區分和新療法開發。
目前已經有幾種基于細胞計數的方法將代謝分析與單細胞表型相結合。熒光代謝探針和代謝物類似物可以通過流式細胞術或顯微鏡進行分析，從而實現單細胞分辨率，它們通常用于代謝預篩選分析，因為它們快速，相對便宜，并且易于適應不同的實驗設置。例如:2- nbdg是一種監測活細胞中葡萄糖攝取的熒光指示劑;BODIPY用作多種熒光磷脂的合成前體;CM-H2DCFDA是細胞中ROS的有用指示物;半胱氨酸-異硫*酸熒光素(FITC)偶聯物監測氨基酸的吸收和積累;單胺尸體堿(MDC)追蹤自噬液泡。
一種基于流式細胞術的創新方法可以用單細胞分辨率分析能量代謝(圖5c)。單細胞能量代謝分析翻譯抑制(SCENITH)基于代謝依賴的翻譯率和嘌呤霉素并入新生蛋白來測量代謝譜。用靶向抑制劑孵育給定樣品，可以從功能上估計葡萄糖和線粒體依賴性、糖酵解、脂肪酸和氨基酸氧化能力。嘌呤霉素化檢測可以與多參數流式細胞術分析相結合，從而分析單細胞復合物和異質樣品。到目前為止，SCENITH已應用于分析離體全血和人類腫瘤活檢。有趣的是， 對腎癌和腫瘤旁組織進行SCENITH與scRNAseq聯合分析，成功地將代謝譜和代謝基因表達聯系起來。此外，SCENITH可用于許多其他腫瘤設置和生理病理條件，包括理解與代謝和氧化還原失衡具有重要和多重聯系的細胞死亡途徑。
2007年，Scott D. Tanner受到流式細胞術技術的啟發，發明了質量細胞術，也被稱為飛行時間細胞術(CyTOF)，這是高維和高通量蛋白質(和代謝)單細胞分析最有前途的技術(圖1)。CyTOF使用非生物可利用的金屬同位素，具有簡明的質譜參數，以取代標準的熒光標記。通常用于流式細胞術?？赏瑫r研究多達50個參數，克服了與重疊發射光譜相關的所有缺陷，這些缺陷通常用于基于熒光的分析(圖5d)。此外，還有一種利用代謝成像來定量組織切片內單細胞酶活性的新方法——通過原位脫氫酶活性測定，定量測定在主要代謝途徑中催化關鍵步驟的五種酶的活性[PPP中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)，糖酵解中的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，乳酸發酵中的乳酸脫氫酶(LDH)，以及TCA循環中的IDH和SDH]，以區分和表征細胞群體 (圖5e)。
圖5. 腫瘤微環境（TME）研究的先進技術的全局概述
精準醫學中的代謝組學和生物信息學方法
在過去的二十年里，已經提出了用于基于MS和NMR 的代謝組學的更先進的數據處理技術，包括用于峰檢測和對齊的軟件（例如 XCMS、MZmine2、Open?MS、MS?DIAL、eRah、ADAP?GC , BinBase)，它可以從大而復雜的數據中進行光譜注釋和識別。統計分析，包括單變量和多變量分析，用于識別顯著表達的代謝物，然后將其與生物學相關聯，通過使?專門工具（例如KEGG）執行的功能分析過程，將代謝物映射到已知的生化途徑。最后，代謝組學數據可以與其他組學數據（轉錄組學、蛋白質組學或微生物組）整合，以充分描繪?物系統的復雜性。
事實上，結合多組學數據的問題更多地與設計適當的策略有關，而不是開發新的分析工具。事實上，關聯分析和分類器的開發已經成功地應用于代謝組學數據，就像以前在基因組、轉錄組學或蛋白質組學數據上用于區分腫瘤亞型一樣。與全基因組關聯研究類似，對生物體液或組織進行了代謝組學分析，目的是確定對不同疾病的易感性標記，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巢癌和胰腺癌。然而，這些研究僅限于樣本生物學的單一維度，需要在獨立的隊列中進行驗證，并且只能找到模式與特定生理病理狀態之間的關聯，這并不能證明因果關系，應從關聯研究轉向確定癌癥中不同水平的基因表達和代謝調節及其失調之間的因果關系和復雜相互關系。
結論與展望
本綜述討論的最新技術和概念進展，從代謝組學到單細胞方法，使代謝成為癌癥生物學研究中最有活力和最富有成果的領域之一。代謝組學是推動這一變革的主要技術，已經展示出在腫瘤學臨床應用中對癌癥研究未來產生巨大潛力的能力。這些分析仍需要更深入地了解定性和定量結果如何反映人體生理的真實情況，以及生物體液中的代謝物組合在多大程度上反映了腫瘤的代謝環境。
過去40年來，新技術的發展、更易獲取的、更強大和更高分辨率的能力推動了癌癥研究前所未有的進展。特別是高通量的單細胞技術的出現為以細胞為分辨率研究癌癥生物學提供了前所未有的工具。這些代謝工具應以互補的方式使用，將描述性研究與功能性研究相結合，為癌癥的研究、診斷和治療開辟創新途徑。通過結合這些技術，能夠擴展對腫瘤的理解，并為新的抗癌策略鋪平道路。
參考文獻
To metabolomics and beyond: a technological portfolio to investigate cancer metabolism. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2023.
請掃描二維碼閱讀原文
繪譜幫你測
代謝流分析(Metabolic Flux Analysis，MFA)利用穩定同位素標記特定的化合物，通過分析下游代謝產物的穩定同位素標記模式，推算出該標記代謝物在細胞內或動物體內代謝通路中的周轉速率、方向和分布規律，從而在動態水平上描述生物體的代謝流向和活性，被廣泛應用于代謝機制研究。麥特繪譜擁有GC-MS與LC-MS兩大檢測平臺，可追蹤含13C和15N等被標記物100+種，覆蓋糖酵解和TCA循環通路、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、一碳代謝、核甘酸代謝通路等。截至2023年5月，我們已協助客戶與合作伙伴發表SCI文章300+篇，累計影響因子3000+，包括Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Signal Transduction and Targeted Therapy, Science Translational Medicine等頂級期刊。獨家的檢測技術、全面的數據報告及專業科研級別的售后探討，助您科研探索之路不斷創新和突破。詳情請咨詢繪譜熱線400-867-2686，獲取詳細資料！
往期回顧
1. 客戶案例 | NC二連發！代謝組學-代謝流技術助力周文教授團隊在多發性骨髓瘤研究中的新突破（二）
2. 客戶案例 | NC二連發！代謝組學-代謝流技術助力周文教授團隊在多發性骨髓瘤研究中的新突破（一）
4. 客戶案例 | IF 12！上海東方醫院研究團隊揭示靶向腫瘤代謝重編程改善食管鱗癌順鉑耐藥的新途徑
5. Cell Metabolism | 腸癌免疫治療療效差，氨積累惹的禍！
