近年來，肥胖已成為世界范圍內主要的公共健康問題。誘發機體肥胖的因素諸多，如機體的能量攝入和消耗之間的不平衡、錯誤的進餐時間、晝夜節律的失調等。其中晝夜節律的失調導致機體外圍生物鐘紊亂，而生物鐘基因的失調又會反過來增加機體在正常的睡眠期間的食物消耗。
已有證據表明，將高熱量的飲食限制在正常活動期（嚙齒動物在夜間，人類在白天）可以改善代謝健康，但其機制尚不清楚。對此，美國芝加哥西北大學范伯格醫學院團隊通過對小鼠開展時間限時進食法（TRF）相關研究揭示了限時進食在控制體重和改善代謝健康中的作用機制，并于2022年10月在國際頂尖學術期刊Science上發表題為“Time-restricted feeding mitigates obesity through adipocyte thermogenesis”的研究成果。
飲食的晝夜節律對能量代謝的影響
在30°C的環境下，為小鼠提供高脂飲食（HFD），將小鼠分為自由進食組、非活動（光照）期進食組（0時至12時）、活動（黑暗）期進食組（12時至24時）。1周后，自由進食組小鼠表現出更多的體重增加；與活動期進食組小鼠相比，非活動期進食組的小鼠體重和呼吸交換比（RER）節律改變增加；在非活動期喂食HFD的小鼠在活動期間的耗氧量低于在活動期喂食HFD的小鼠，且僅在活動期喂食的小鼠的總能量消耗與體重的斜率更高。這些結果表明，在環境光-暗周期的非活動階段進食會導致體重增加，即飲食誘導的能量消耗減少。
運用葡萄糖標記的體內同位素示蹤技術，進一步探究小鼠脂肪組織中糖酵解和三羧酸（TCA）循環代謝受喂食時間的影響。TRF小鼠口服U-13C-葡萄糖（0時喂食非活動期小鼠，12時喂食活動期小鼠），被標記的葡萄糖被腹股溝白色脂肪組織（iWAT）和棕色脂肪組織（BAT）迅速吸收，并在喂食15 min后達到峰值。與非活動期喂養小鼠的iWAT和BAT相比，活動期喂養小鼠的iWAT和BAT中增加了帶標記的丙酮酸和乳酸，表明糖酵解增強和標記乳酸的可能攝取，且活動期喂養的小鼠iWAT中也富含了被標記的TCA循環中間產物。這表明相對于飲食的晝夜規律影響了脂肪組織中的碳通量，活動期進食將促進脂肪組織中葡萄糖向糖酵解和TCA循環代謝物的生成增加。
圖1. 飲食的晝夜節律對能量消耗的影響
脂肪細胞中的產熱增強機制
進一步分析0時和12時小鼠iWAT和BAT中對應的生物鐘基因表達的差異。結果表明，僅在活動期喂食HFD的小鼠iWAT和BAT中核心生物鐘基因表達高于非活動期喂食HFD的小鼠，提示脂肪細胞的晝夜節律和產熱節律的紊亂可能是在非活動期進食的負面代謝后果的基礎。
成年小鼠脂肪細胞鋅指蛋白423（ZFP423）的誘導缺失代表了更強的產熱刺激，因此對ZFP423轉錄因子敲除（Zfp423-KO）的小鼠進行限時進食，發現iWAT脂肪細胞的廣泛積累和產熱作用的激活，且非活動期間喂食HFD的小鼠脂肪細胞ZFP423的缺失有效阻止了小鼠體重增加并改善了葡萄糖耐量。這表明，增強脂肪細胞產熱可以減少非活躍期喂食期間的體重增加。
對Zfp423-KO小鼠WAT血管部分分化的原代脂肪細胞進行生物能和代謝流分析，結果發現，與對照組相比，脂肪細胞Zfp423-KO小鼠的耗氧率增加。U-13C-葡萄糖同位素示蹤表明，用去甲腎上腺素（NE）刺激后的脂肪細胞和用β3腎上腺素能受體激動劑刺激的棕色脂肪細胞的糖酵解通量增加；Zfp423-KO的脂肪細胞中的U-13C-葡萄糖向糖酵解中間體和終產物（包括丙酮酸鹽和乳酸鹽）的代謝流入增加，即脂肪細胞的產熱增加。
使用代謝組學分析評估脂肪細胞特異性缺失Zfp423后的代謝特征改變。與對照脂肪細胞相比，Zfp423-KO的脂肪細胞中肌酸、丙酮酸和乳酸的水平增加，磷酸肌酸和ATP的水平減少；Zfp423-KO小鼠iWAT中的PCr/Cr比率降低，產熱脂肪中無效肌酸循環的主要激酶同工酶—肌酸激酶B（CKB）的豐度增加。整體表明，Zfp423的缺失通過增加解偶聯呼吸、增強NE刺激的呼吸、增加進入糖酵解的葡萄糖通量和增加肌酸循環來促進脂肪細胞產熱。
圖2. Zfp423的缺失通過增加糖酵解的葡萄糖通量和肌酸循環來增強脂肪細胞的產熱作用
iWAT和BAT脂肪細胞的轉錄組學&代謝組學特征分析
對熱中性小鼠iWAT和BAT的脂肪細胞進行轉錄組學測序，結果觀察到大多數基因在晝夜周期ZT19-7階段達到最大豐度，而較少的基因在ZT7-19階段表達。KEGG通路分析顯示，在ZT19-7階段的差異基因主要與信號通路、代謝途徑和細胞維持途徑相關；在ZT7-19階段，TCA循環、生熱、氧化磷酸化和晝夜節律相關的KEGG通路被富集；ZT3-15階段主要參與炎癥的KEGG通路；而在ZT15-3階段，可以觀察到氧化磷酸化、產熱、丙酮酸和碳代謝、活性氧和TCA循環等代謝途徑。
iWAT代謝組學研究結果揭示，熱中性小鼠的肌酸豐度和PCr/Cr比值在一整天都有節律性，CKB蛋白在ZT13處最為豐富；活動期進食的小鼠在ZT13期間iWAT的肌酸豐度達到峰值，而這在非活動期進食的小鼠中是缺乏的；兩組小鼠iWAT中CKB蛋白的積累時間相似。因此，豐富的肌酸和無效肌酸循環在脂肪組織中是有節律性的。
圖3. 轉錄組學揭示了脂肪細胞代謝的晝夜節律性
肌酸代謝介導的脂肪細胞生物鐘節律性
隨后對缺乏核心時鐘激活因子肌肉arnt樣蛋白1（Bmal1-KO）的原代脂肪細胞進行基因組和代謝組學分析。在脂肪細胞Bmal1-KO小鼠的iWAT中，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、蛋氨酸腺苷轉移酶2A（MAT2A）和CKB的豐度顯著降低；脂肪細胞Bmal1-KO小鼠在活動期及非活動期喂食HFD的體重增加相同，具有相似的糖耐量，這表明脂肪細胞時鐘在TRF期具有顯著的代謝益處。此外，Bmal1-KO的原代脂肪細胞中肌酸豐度及代謝基因的表達降低，PCr/Cr比值增加，肌酸無效循環收到抑制。但當給對照和Bmal1-KO小鼠喂食添加肌酸的HFD后，Bmal1-KO脂肪細胞顯著恢復了小鼠的體重增加、葡萄糖穩態的損失以及iWAT肌酸和SAM的數量，而食物攝入量和活性沒有變化。整體的基因組和代謝組學結果表明，脂肪細胞分子時鐘產生與活動周期一致的節律性由肌酸合成和代謝來介導。
最后，以具有可誘導脂肪細胞特異性轉基因表達BMAL1（Bmal1-Tg）的小鼠為對象，研究在缺乏脂肪細胞BMAL1的小鼠中增加肌酸豐度是否可以恢復飲食誘導的生熱。結果發現當脂肪細胞Bmal1-Tg小鼠在熱中性下喂食HFD時，經體重調整后的活動及非活動期的耗氧量均顯著增加；脂肪細胞Bmal1-Tg小鼠的葡萄糖耐受量也得到了改善；脂肪細胞Bmal1-Tg小鼠在iWAT中肌酸循環增加，Ckb和Gatm的表達增加。因此得出結論，放大脂肪細胞的核心時鐘節律足以增加能量消耗，減少體重增加。
圖4. 脂肪細胞生物鐘節律性通過肌酸代謝調節
綜上所述，本文通過對小鼠開展時間限時進食法（TRF）研究，發現脂肪細胞肌酸代謝的晝夜節律控制是飲食誘導的生熱時間的基礎，確定了脂肪細胞時鐘在飲食誘導的生熱過程中的主要作用。這些發現揭示了肌酸節律性介導的生熱是驅動限時進食代謝益處的重要機制，為控制體重和改善人類代謝健康提供了新的方向。
參考文獻
Hepler C, Weidemann BJ, Waldeck NJ, et al. Time-restricted feeding mitigates obesity through adipocyte thermogenesis. Science. 2022.
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