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“在過去的一年里，人類干細胞衍生的類器官作為細胞系模型和動物模型的橋梁，已經成為了新冠肺炎研究的有力工具【1】。”對于新冠肺炎這類呼吸性疾病的研究，最常見的體外模型是肺類器官，即：由干細胞在體外進行3D培養，形成包含多種組織特異的細胞類型、可以自組裝并部分模擬原生器官的結構和功能的“微器官”。
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肺的類器官培養需要在體外模擬胚胎發育的過程。肺上皮來源于內胚層，通過一系列復雜的內胚層-中胚層介導的信號通路調控，經歷內胚層誘導、前-后和背-腹模式化、肺發育、肺出芽、分支形態發生，最終生成樹枝狀傳導氣道網絡（支氣管、細支氣管）和氣體交換單元（肺泡）。通過調整培養基的生長因子種類和含量，也可以在22天左右形成具有高度增殖能力的芽尖祖細胞類器官（bud tip progenitor organoid），這個結構具有體外多系分化潛能和體內移植潛能，因此芽尖祖細胞類器官是探索上皮命運決定的理想選擇。而人肺類器官（human lung organoid, hLOs）的培養需要大約50-85天，適用于模擬人肺發育過程中的上皮-間充質轉換。這兩種類器官都在再生醫學、組織工程和藥物安全性、有效性測試中發揮著重要作用。
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本篇文章基于Nature protocols【2】和elife【3】發表的兩篇文章，整理了人類多能干細胞（hPSCs）來源的hLOs培養方案。
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圖1. hPSCs來源的芽尖祖細胞類器官或hLOs培養方案【2】
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細胞來源
hPSCs
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培養基配方
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hPSCs培養和傳代
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1. 將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel溶液分布均勻。隨后轉移至37℃條件下孵育10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
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2. 將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO2的培養箱中，培養至細胞匯合度約為75-85%、且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
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3. 向hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），并將培養皿放置在37℃條件下進行解離約5-10min，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式漂浮。
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4. 向每個孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀釋Dispase。
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5. 將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉淀細胞。加入DMEM-F12培養基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養板中，向每個孔中加入0.5ml預熱的mTeSR1進行培養，至細胞匯合度達到45-75%。
定向分化為內胚層和前腸球體
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6. 將24孔板內的mTeSR1每天按照上表中第1-4天內胚層分化培養基組分進行換液，并將平板放回37℃，5%CO2的培養箱中。
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7. 吸出第4天內胚層分化培養基，替換為每孔0.5ml預熱的前腸內胚層分化培養基，并將平板放回37℃，5%CO2的培養箱中。在第5-9天，每天更換培養基。培養至第8-9天左右會形成分離的、漂浮的球狀體。
收集漂浮的前腸球體
漂浮前腸球體的收集通常在配有體式顯微鏡的層流罩或半無菌罩中進行，整個過程中需確保無菌技術和無菌環境。
8. 將含有前腸球體的24孔培養板置于顯微鏡下。在不破壞單層細胞的情況下，用移液器吸頭輕輕移出自由漂浮的球體，并將其轉移到1.5ml的離心管中。讓球狀體在離心管底部沉降5-10 min，必要情況下可以用微量離心機低速離心10s。
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9. 將吸出的球體接種于200μl 含蛋白濃度8.0mg/ml的Matrigel膠中，輕輕吹打混勻，迅速操作并防止氣泡產生。
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10. 在24孔板的每個培養孔中心接種25μl 混合液，放入37℃培養箱中靜置10min。待Matrigel凝固后，加入0.5ml hLOs培養基或芽尖祖細胞類器官培養基進行培養。
A、培養hLOs
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11A. 向各孔中加入0.5ml hLOs培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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12A. 如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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13A. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨后將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，吸去所有培養基。
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14A. 向離心管中添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養孔中心接種50μl 混合液，目的是在每個孔內植入1-3個類器官。待Matrigel在37℃培養箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml hLOs培養基進行培養。
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15A. 每2-3周重復步驟12A-14A。一旦前腸球體被置于Matrigel中，大約需要50天可以形成具有基底細胞、粘液分泌細胞、纖毛細胞，以及肺間充質細胞類型和原始肺泡細胞類型包圍的假復層上皮結構。隨著時間的推移，培養60-85天的類器官狀態最佳。
B、生成芽尖祖細胞
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11B. 向各孔中加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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12B. 如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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13B. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。
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14B. 隨后將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，高速（約6000g）離心3-5s，或低速（約300g）離心3min。離心后，上皮碎片將沉降到底部，Matrigel繼續懸浮在培養基中，細胞團沉積在離心管底部。
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15B. 在顯微鏡下用移液器取出培養基和Matrigel，向沉淀的細胞團內添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養孔中心接種25μl 混合液。待Matrigel在37℃培養箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基進行培養。
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16B. 每2-3天按照步驟12B-15B進行傳代。
培養芽尖祖細胞類器官
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17B. 在芽尖祖細胞培養約2周后，會形成一個幾乎均質的芽尖祖細胞群體。向各孔中加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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18B. 如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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19B. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨后將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，吸去所有培養基。
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20B. 向離心管中添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養孔中心接種50μl 混合液。待Matrigel在37℃培養箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基進行培養。
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由于含有芽尖祖細胞，在類器官周圍的芽尖內部會出現SOX2+氣道狀結構，可以分化為粘液分泌細胞。粘液和細胞碎片通常會聚集在類器官的腔中，因此需要在顯微鏡下將這些光學致密、顆粒狀的雜質去除。
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21B. 將Matrigel轉移至預熱的DMEM-F12培養皿中，用無菌手術刀將類器官切成兩半。取1ml注射器吸滿DMEM-F12，輕輕推出培養基，沖洗類器官中的粘液等雜質。
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圖2.hLOs和芽尖祖細胞類器官的生長模式【2】
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hLOs主要由肺的上皮和間葉部分組成，其結構特征與天然肺相似。利用RNA測序，Dye, B. R.et al.【3】發現hLOs與人類胚胎肺在全球轉錄譜上非常相似，這表明hLOs是研究人類肺發育、成熟和疾病的一個極好的模型。
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圖3. hLOs和人胚胎肺的相關性很高【3】
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類器官作為一種研究模型，在發育生物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養技術建立過程中會面臨多種挑戰。為了更輕松更高效的建立類器官培養技術，歡迎各位掃碼加入類器官培養交流群，在這里會有專業的技術支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！
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參考文獻：
【1】VAN DER VAART, Jelte, et al. Advancing lung organoids for COVID-19 research. Disease Models & Mechanisms, 2021, 14.6: dmm049060.
【2】MILLER, Alyssa J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2019, 14.2: 518-540.
【3】DYE, Briana R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. elife, 2015, 4: e05098.
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