晝夜節律紊亂被視為癌癥預后不良的一個標志，然而睡眠不足（SD）促進腫瘤發生的生理過程仍不明確；已有研究表明脂肪酸氧化（FAO）失調可增強腫瘤惡性特征，特別是作為FAO的限速酶，ACSL 1在癌癥中高表達，但其節律性破壞的作用未知；已知β-內啡肽，一種內源性具有類似嗎啡作用肽類物質，其晝夜振蕩與生物鐘穩態相關，具有抑制癌癥的潛能，但不同的給藥節律是否能減輕腫瘤尚待研究。
2024年5月，大連醫科大學腫瘤干細胞研究院劉強教授團隊在Cell Metabolism上發表了題為“Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis”的研究論文近期，揭示了FAO是一種將睡眠不足與肺腫瘤發生聯系起來的晝夜節律傳感機制，并為患有睡眠不足相關癌癥的患者提供了一種β-內啡肽時間節律治療策略。
技術路線圖
FAO：脂肪酸氧化；SD：睡眠不足/睡眠剝奪；ACSL1：?；o酶A合成酶長鏈家族成員1；PA：棕櫚酸；PA-CoA：棕櫚酰肉堿輔酶A；CLOCK：晝夜節律穩態核心基因
研究結果
1. 脂肪酸氧化可感知睡眠剝奪導致的節律紊亂
為了探究睡眠剝奪（SD）對小鼠肺部生理節律的影響，對SD處理后不同時間點的小鼠肺組織進行組學檢測。轉錄組測序篩選出3284個在SD后喪失晝夜振蕩的基因，GO富集分析顯示這些基因在脂質代謝相關的生物過程中富集，尤其是脂肪酸氧化（FAO）。隨后的UHPLC-MS代謝組學進一步證實，SD處理使得小鼠肺組織中晝夜振蕩的脂質代謝物數量顯著減少， 47種脂質物質發生節律紊亂，其中游離脂肪酸占比最大。
以上結果表明，在基因表達和代謝功能層面，FAO均能夠感知生理條件下SD誘導的節律紊亂。
圖1. FAO可感知SD處理導致的晝夜節律紊亂
2.睡眠剝奪通過脂肪酸氧化增強癌細胞干性
在此基礎上，進一步探討SD誘導的FAO節律紊亂是否在肺癌發展中發揮作用，為此構建了肺癌小鼠模型并實施SD處理，通過CT圖像、HE染色和IHC等結果確認了肺癌形成和干細胞標志物的表達。
為明確SD促進腫瘤發生的機制，對小鼠肺癌組織進行轉錄組測序，結果顯示SD顯著上調了與FAO相關的基因表達。此外，脂質代謝組檢測也表明，SD處理后脂肪酰肉堿增加，游離脂肪酸減少，且脂肪酸氧化的最終產物乙酰輔酶A和腺苷三磷酸在肺癌中增加，并在SD條件下表現出節律紊亂。此外，向SD小鼠給予脂肪酸氧化抑制劑：依托莫司他（ETO），可逆轉肺癌進展及干細胞特性的增強。
以上結果表明，FAO感知晝夜節律紊亂是睡眠剝奪增強肺癌干細胞特性的基礎。
圖2. FAO節律紊亂增強SD誘導的肺癌細胞干性
3. ACSL1及其產物PA-CoA發揮重要作用
接下來尋找SD誘導FAO節律紊亂從而促進肺癌干細胞特性的關鍵分子。首先從轉錄組結果里篩選出13個同時響應節律紊亂和腫瘤進展的FAO基因，其中ACSL1在mRNA和蛋白水平均顯著上調。在小鼠體內特異性敲除該基因可逆轉SD促進的腫瘤進展，下調腫瘤組織中干細胞標志物的表達。
隨后從脂質組檢測結果里篩選可能作為ACSL1底物和產物的長鏈FAO代謝產物，發現SD可降低腫瘤組織中的棕櫚酸（PA）水平。敲低ACSL1可恢復SD誘導的PA下降，而補充棕櫚酰肉堿輔酶A（PA-CoA）——PA進入FAO的活化態，可挽救ACSL1缺失下被抑制的癌癥干細胞特性和腫瘤生長。
以上結果表明，SD擾亂ACSL1的節律，過度激活了它將PA轉化為PA-CoA的能力，從而促進FAO，最終導致腫瘤生長。
圖3. ACSL1合成的PA-CoA有助于SD誘導的肺癌細胞干性
4. ACSL1的上游調控者是CLOCK
在分子機制方面，首先在不同的細胞系中發現有兩種核心生物鐘基因：CLOCK和BMAL1，與ACSL1的表達量正相關。隨后在腫瘤模型中進行驗證，發現SD僅破壞CLOCK基因的節律振蕩，而對BMAL1無顯著影響。此外，通過分析表觀組學公共數據庫，發現CLOCK和BMAL1在多種細胞中均占據了ACSL1的啟動子區域，并且通過CHIP-qPCR和熒光素酶報告基因分析確認了結合位點。作為驗證，分別在鼠源和人源兩種腫瘤模型中敲除CLOCK基因，均觀察到了腫瘤生長和干細胞特性被抑制的現象。
以上結果表明，核心生物鐘基因CLOCK可能通過直接結合到ACSL1啟動子上的特定區域來調控該基因的表達。
圖4. ACSL1可感知SD誘導的FAO節律失常，促進肺癌發生
5. ACSL1誘導CLOCK發生棕櫚?；揎棧S持其穩定性
進一步的研究發現，敲低ACSL1會反過來降低CLOCK的蛋白水平，但不影響其mRNA水平，說明ACSL1可通過某些機制維持CLOCK的蛋白穩定性；同時考慮到ACSL1催化的PA-CoA可以做為蛋白質棕櫚酰化的底物，因此研究者探討了棕櫚?；揎椩贏CSL1和CLOCK互作中的作用。
首先利用?；?生物素交換（ABE）和免疫印記等技術手段，證實了CLOCK蛋白上確實存在棕櫚?；揎?。然后使用siRNA篩選出了23種可能的棕櫚酰轉移酶，通過敲低和過表達實驗確定了其中的ZDHHC5可介導CLOCK的棕櫚酰化。此外，還發現SD 處理一方面以ACSL1依賴的方式增強了CLOCK的棕櫚?；揎?，另一方面也破壞了這一修飾的晝夜節律性。隨后，通過在線預測網站swisspalm鑒定了CLOCK的棕櫚酰化位點：Cys194，該位點在多物種中保守。進一步地，CLOCK蛋白的降解和泛素化實驗表明，棕櫚?；ㄟ^抑制泛素化依賴的蛋白酶體降解來穩定CLOCK蛋白。
以上結果表明，ACSL1通過ZDHHC5使得CLOCK在Cys194上發生棕櫚酰化修飾，而這一修飾可阻止CLOCK因泛素化而降解，從而維持該蛋白的穩定性。
圖5. ACSL 1通過ZDHHC 5對CLOCK進行棕櫚?；揎?，以此穩定CLOCK蛋白
6. 節律性的β-內啡肽給藥可作為一種治療方案
基于上述SD對腫瘤發生發展的影響，研究者考慮基于晝夜節律的內分泌治療方案。對體外培養的肺癌細胞系分別添加14種睡眠相關激素，發現β-內啡肽（Endor）可顯著下調CLOCK和ACSL1的mRNA表達水平，因此后續對β-內啡肽展開節律治療應用的研究。
對于SD條件下的荷瘤小鼠，研究人員設計了3種β-內啡肽給藥方案：每日16:00給藥（ZT8-Endor）、每日4:00給藥（ZT20-Endor）以及持續給藥（pump-Endor）。從表型來看，ZT8-Endor方案顯著逆轉了SD導致的腫瘤生長，而另外兩種方案效果不顯著。接下來使用ELISA評估了血清β-內啡肽水平，發現SD處理破壞了β-內啡肽的晝夜節律并使其保持在較低水平， 另外三種給藥處理雖都能提高β-內啡肽含量，但僅ZT8-Endor能使其晝夜節律也恢復正常。同樣地，在ACSL1和CLOCK含量和腫瘤干性標志物等指標上也存在類似的規律。
圖6. β-內啡肽可恢復受到SD干擾的CLOCK/ACSL1節律
7. 人群隊列驗證
最后為評估以上研究的臨床轉化潛力，進行了人群隊列的前瞻性和回顧性研究。肺癌患者的前瞻性隊列數據表明，血清β-內啡肽濃度與睡眠質量正相關，且是癌癥發展的潛在預測因素；既往肺癌病例的回顧性分析結果表明，血清β-內啡肽與較好的預后和生存率有關，而與CD166和Ki-67（兩種腫瘤標志物）的表達水平負相關。
總而言之，這兩組隊列數據提供了SD、β-內啡肽、CLOCK和ACSL1可能是肺癌獨立預后因素的臨床證據。
圖7. 肺癌患者的睡眠質量和β-內啡肽水平與CLOCK/ACSL1表達及預后不良呈負相關
研究結論
本研究揭示了睡眠不足（SD）與肺癌發生發展之間的潛在機制，發現了SD可導致脂肪酸氧化（FAO）紊亂，進而促進肺癌干細胞的形成和腫瘤生長。在這一過程中，ACSL1基因與CLOCK基因之間的正反饋循環起到了關鍵作用。在治療階段，通過定時給予β-內啡肽，可以有效逆轉SD引起的晝夜節律紊亂和FAO紊亂，從而減輕腫瘤的生長。此外，研究證實睡眠質量和血清β-內啡肽水平與肺癌患者的預后不良密切相關。這一發現表明，FAO作為一種晝夜節律感知機制，在連接睡眠不足與肺腫瘤進展方面具有重要意義。
參考文獻
Peng F, Lu J, Su K, et al. Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis. Cell Metab. 2024.
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