BMC Medicine | 血清代謝物應(yīng)用于乙肝患者肝纖維化診斷-國(guó)內(nèi)聚焦-資訊-生物在線

BMC Medicine | 血清代謝物應(yīng)用于乙肝患者肝纖維化診斷

作者：麥特繪譜生物科技（上海）有限公司 2020-06-09T09:31 (訪問(wèn)量:12635)

慢性肝病會(huì)誘發(fā)肝纖維化并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。肝組織活檢目前仍然是評(píng)價(jià)肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于組織活檢具有創(chuàng)傷性、樣本誤差等問(wèn)題導(dǎo)致在臨床上的應(yīng)用受到限制，因此非創(chuàng)傷性的準(zhǔn)確可靠的診斷指標(biāo)亟需開(kāi)發(fā)。賈偉教授團(tuán)隊(duì)與上海中醫(yī)藥大學(xué)劉平教授團(tuán)隊(duì)合作通過(guò)對(duì)兩個(gè)研究隊(duì)列受試者進(jìn)行血清靶向定量代謝組學(xué)研究，篩選出4個(gè)代謝物指標(biāo)并建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型進(jìn)行疾病診斷，相關(guān)成果于2020年6月5日在《BMC Medicine》期刊在線發(fā)表。

血清代謝物篩選及診斷模型選擇

隊(duì)列一納入1006名受試者，其中504名慢乙肝患者（CLD），502例健康對(duì)照。隊(duì)列二納入390例受試者，其中300例慢乙肝患者，90例健康對(duì)照。除了失代償性肝硬化患者，其他疾病患者均接受肝組織活檢檢測(cè)進(jìn)行疾病分期判斷。

我們采用靶向代謝組學(xué)定量測(cè)定血液樣本中24種膽汁酸、42種游離脂肪酸、32種氨基酸，其中26種代謝物在CLD vs正常、肝纖維化vs肝硬化、肝纖維化不同階段中存在顯著差異。根據(jù)LASSO算法和隨機(jī)森林（RF）算法共篩選出4種代謝物，分別為反式亞油酸（linoelaidic acid，C18:2，n6t）、牛磺膽酸（taurocholate，TCA）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）和纈氨酸（valine，Val）。此外，還發(fā)現(xiàn)Tyr/Val比值可以進(jìn)一步提高分類性能以及年齡也是區(qū)分纖維化和肝硬化以及纖維化不同程度的危險(xiǎn)因素。4種代謝物與纖維化分期、壞死性炎癥、CPA、AST、ALT、AST/ALT、PLT、FIB-4、APRI進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。四個(gè)代謝物(包括Tyr/Val)比現(xiàn)有臨床指標(biāo)與纖維化程度均呈現(xiàn)更強(qiáng)的相關(guān)性。

為了確定一個(gè)合適的分類模型，我們?cè)陉?duì)列一中采用10倍交叉驗(yàn)證(CV)來(lái)比較代謝物構(gòu)建的RF模型和兩個(gè)線性模型（logistic回歸（LR）、線性判別分析（LDA））以及與臨床指數(shù)、APRI、AST/ALT、FIB-4之間的診斷能力。以CV-受試者工作特征曲線（ROC）下的面積(CV- AUROC)和CV-精確率曲線(PR)下的面積(CV- AUPR)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，診斷區(qū)分CLD和健康組, APRI、LR、LDA和RF模型的AUROCs和AUPR都很高，但RF模型具有最強(qiáng)的分類性能。在診斷纖維化和肝硬化、早期肝纖維化（S0-2）與晚期肝纖維化（S3-4）上，RF模型的CV-AUROC和CV-AUPR優(yōu)于其他方法。經(jīng)過(guò)綜合比較，基于決策樹(shù)的集成學(xué)習(xí)算法RF表現(xiàn)出更好的分類性能。

模型的構(gòu)建

模型一：診斷CLD患者與健康組

CLD患者中反式亞油酸濃度(C18:2，n6t)顯著降低，而TCA、Tyr、Tyr/Val水平均高于對(duì)照組。隊(duì)列一中利用這四種代謝物標(biāo)志物建立RF模型進(jìn)行CLD患者和NC患者診斷，采用袋外數(shù)據(jù)(out of bag, OOB)進(jìn)行RF模型評(píng)估。該模型AUROC和AUPR 分別達(dá)到0.997和0.994，明顯高于APRI (AUROC=0.973, p<0.001), FIB-4 (AUROC=0.848, p<0.001)和AST/ALT (AUROC=0.665, p<0.001)。其中，C18:2，n6t濃度越低、TCA濃度越高意味著CLD的風(fēng)險(xiǎn)越高。

基于OOB概率預(yù)測(cè)，采用logit函數(shù)計(jì)算模型一RF得分。瀑布圖顯示RF評(píng)分從NC(較低的RF得分)到CLD(較高的RF得分)有明顯的上升趨勢(shì)，兩組間RF得分存在顯著差異(p<0.001)。在訓(xùn)練集cutoff值為0.434時(shí)，CLD患者診斷敏感性為98.4%，特異性為99%。當(dāng)RF模型中使用Youden index產(chǎn)生最佳臨界值的敏感性和特異性優(yōu)于AST/ALT、APRI和FIB-4。

模型二：區(qū)分CLD中肝纖維化患者和肝硬化患者

利用四種代謝物標(biāo)志物和年齡建立RF預(yù)測(cè)模型以預(yù)測(cè)CLD肝硬化患者與非肝硬化患者。基于OOB預(yù)測(cè)，該模型AUROC為0.941，AUPR為0.87，優(yōu)于APRI (AUROC=0.698, p<0.001) 、AST/ALT (AUROC=0.815, p<0.001)、FIB-4 (AUROC=0.869, p<0.001)。決策樹(shù)顯示Tyr/Val、酪氨酸、反式亞油酸水平越高,肝硬化風(fēng)險(xiǎn)就越高。RF模型臨界值為0.01對(duì)肝硬化與纖維化有效區(qū)分時(shí)，模型敏感性為87.0%,特異性90.4%。對(duì)HBV-DNA水平、壞死性炎癥程度、HBeAb、HBeAg、BMI、血小板(PLT)、肝功(如凝血酶原時(shí)間、白蛋白、直接膽紅素、間接膽紅素)和藥物(恩替卡韋)進(jìn)行校正后，RF得分依然顯著 (p < 0.001)，且敏感性和特異性均顯著優(yōu)于AST/ALT、APRI和FIB-4。

模型三：CLD中纖維化的分級(jí)

在本研究將肝纖維化0-2期歸為早期纖維化（S0-2），3-4期被定義為晚期纖維化（S3-4）。根據(jù)年齡和四種代謝物標(biāo)志物建立模型三用于區(qū)分早期纖維化和晚期纖維化，模型AUROC為0.918和AUPR為0.892，比APRI (AUROC=0.647, p<0.001),AST/ALT(AUROC=0.714, p<0.001),FIB-4（AUROC=0.802, p<0.001)更優(yōu)。決策樹(shù)顯示，Tyr/Val、Tyr、年齡和TCA越高，晚期肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)越高。

logit診斷RF得分臨界值為-0.115可將早期纖維化患者與晚期纖維化患者區(qū)分開(kāi)來(lái)，該模型敏感性為86.7%，特異性為90.5%。對(duì)HBV-DNA水平、壞死性炎癥程度、HBeAb、HBeAg、肝功能、血小板、BMI和藥物(恩替卡韋) 進(jìn)行校正后，RF得分仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p < 0.001)，且敏感性和特異性均顯著優(yōu)于AST/ALT、APRI和FIB-4。

在獨(dú)立HBV隊(duì)列(隊(duì)列二)中驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型

隊(duì)列二中的樣本進(jìn)行了相同的代謝組學(xué)研究，獲得與隊(duì)列一相似的代謝物濃度結(jié)果。對(duì)于CLD診斷,與APRI (AUROC=0.879, AUPR=0.958)、AST/ALT(AUROC=0.603, AUPR=0.849)、FIB-4 (AUROC=0.707, AUPR=0.897) 相比,構(gòu)建的模型一依然具有更強(qiáng)分類性能，其AUROC為0.977和AUPR為0.993。此外,使用隊(duì)列一中模型一的cutoff值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示隊(duì)列二的RF得分診斷CLD的敏感性為92.2%,特異性為94.4%。模型二區(qū)分肝硬化患者和纖維化患者的AUROC為0.844和AUPR為0.827，比APRI (AUROC=0.608, p<0.001)、AST/ALT (AUROC=0.684, p<0.001)、FIB-4 (AUROC=0.758, p<0.001)更優(yōu)。使用隊(duì)列一中模型二的cutoff值進(jìn)行分析，模型二RF得分區(qū)分肝硬化患者和纖維化患者的敏感性為71.8%,特異性為81.6%。同樣，模型三區(qū)分纖維化階段的AUROC為0.807和AUPR為0.817，比APRI (AUROC=0.595, p<0.001)、AST/ALT (AUROC=0.667, p<0.001)、FIB-4 (AUROC=0.739, p= 0.01)更優(yōu)。模型三RF得分區(qū)分纖維化S0-2期和S3-4期的敏感性為72.9%，特異性為76.1%。

此外，引入重分類改善指標(biāo)(NRI)和積分判別改進(jìn)(IDI)來(lái)量化模型對(duì)現(xiàn)有臨床指標(biāo)診斷的改進(jìn)。對(duì)不同分類目標(biāo)(健康與CLD、肝纖維化與肝硬化、早期肝纖維化與晚期肝纖維化)分析中, 與FIB-4、APRI、AST/ALT相比，RF模型的NRI和IDI均得到陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明代謝物建立的模型具有更好的分類表現(xiàn)。

S0-2、S3和S4多分類診斷

除了進(jìn)行二分類分析外，我們還進(jìn)一步分析了篩選到的潛在標(biāo)志物是否可以對(duì)CLD患者進(jìn)行多分類分析。于是重新構(gòu)建RF模型，分別對(duì)APRI、AST/ALT和FIB-4進(jìn)行多元回歸以診斷隊(duì)列1中S0-2期患者、S3期患者和S4期患者。在隊(duì)列一中，與APRI (AUROC=0.790, AUPR=0.658)、AST/ALT (AUROC=0.817, AUPR=0.688)、FIB-4 (AUROC=0.858, AUPR=0.774)相比，預(yù)測(cè)模型AUROC為0.944，AUPR為0.908。隊(duì)列2驗(yàn)證集中，與APRI (AUROC=0.790, AUPR=0.608)、AST/ALT (AUROC=0.772, AUPR=0.597)、FIB-4 (AUROC=0.816, AUPR=0.699)相比，預(yù)測(cè)模型AUROC為0.841 (0.799-0.885)，AUPR為0.748(0.674-0.81)。比較各模型的診斷表現(xiàn)，結(jié)果顯示代謝物多分類模型優(yōu)于其他方法。

小結(jié)

隨著世界范圍內(nèi)CLD患病率的上升，對(duì)該病嚴(yán)重程度進(jìn)行準(zhǔn)確可靠評(píng)估對(duì)治療方式選擇和縱向監(jiān)測(cè)越來(lái)越重要。越來(lái)越多的研究嘗試開(kāi)發(fā)可替代肝活檢的無(wú)創(chuàng)CLD診斷工具，例如目前已經(jīng)被廣泛報(bào)道的AST/ALT、APRI和FIB-4。非侵入性評(píng)估方法方便同一個(gè)患者定期連續(xù)監(jiān)測(cè)（例如每3個(gè)月或每半年），動(dòng)態(tài)反映該患者的肝纖維化和肝硬化變化狀況，可用于療效監(jiān)測(cè)，預(yù)后判斷，更適合臨床應(yīng)用。本研究確定了一組代謝物標(biāo)志物，包括反式亞油酸、TCA、Tyr，以及與CLD進(jìn)展高度相關(guān)的Tyr/Val。本研究中，首先通過(guò)單變量、LASSO和RF分析，確定顯著差異代謝物作為候選標(biāo)記物，并構(gòu)建了相應(yīng)的RF預(yù)測(cè)模型。雖然模型在驗(yàn)證集中AUROC不如訓(xùn)練集AUROC高，依然獲得了相對(duì)較好的AUROC(均為>0.8)。此外，當(dāng)機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究時(shí)，外部驗(yàn)證/準(zhǔn)確性測(cè)試下降是一個(gè)常見(jiàn)的事實(shí)，不過(guò)幾種代謝物的AUROC和AUPR仍明顯大于AST/ALT、APRI和FIB-4，表明代謝物模型具有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究也存在幾個(gè)局限性：

(1)藥物使用是本研究中的混雜因素，雖然對(duì)藥物使用校正后沒(méi)有改變，但仍需要更大規(guī)模的研究來(lái)進(jìn)一步評(píng)估；

(2)本研究中HBV感染是CLD發(fā)生的唯一或主要原因且研究對(duì)象均為中國(guó)人，因此，對(duì)于其他病因或其他種族/民族群體還需進(jìn)一步驗(yàn)證；

(3)除了橫斷面研究，還應(yīng)進(jìn)行縱向研究，特別是用于區(qū)分早期和晚期肝纖維化。

綜上所述，我們通過(guò)靶向代謝組學(xué)分析，確定了四種代謝標(biāo)志物可以準(zhǔn)確區(qū)分CLD患者與健康者，并可區(qū)分不同階段肝纖維化。非侵入性代謝物診斷性能優(yōu)于FIB-4、AST/ALT、APRI。如果在未來(lái)的研究中得到驗(yàn)證，那么這種方式將有助于減少不必要的肝活檢來(lái)確定患者有無(wú)顯著纖維化，評(píng)估CLD進(jìn)展程度。

參考文獻(xiàn)

Guoxiang Xie, Xiaoning Wang , et al., Serum metabolite profiles are associated with the presence of advanced liver fibrosis in Chinese patients with chronic hepatitis B viral infection. BMC Medicine, (2020) 18:144. https://doi.org/10.1186/s12916-020-01595-w.

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