細胞凋亡檢測的方法

1、?早期檢測:
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測
2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測
3)細胞色素C的定位檢測
4) 線粒體膜電位變化的檢測

2、?晚期檢測：
細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。
對于晚期檢測通常有以下方法：
1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)
2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
3、生化檢測：
1）典型的生化特征：DNA 片段化
2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等
3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）
4）通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果?？勺黾毎麘乙?、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

4、LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。

5、其它方法：
1）Telemerase Detection (端粒酶檢測)
端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。

2）mRNA水平的檢測
研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

5、細胞內氧化還原狀態改變的檢測：
正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內GSH的排除非?；钴S時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
6、細胞色素C的定位檢測
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測：
1）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系
2）近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。
3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變，這是由于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。

8、線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據：
1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。
2）形態學觀察，看到細胞數目有限，統計學上的準確性受影響；
3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例；
4）流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。

用于流式細胞儀檢測的染料：
PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst常用。
PI和Hoechst33342雙標：
PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。
故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。
PI和Annexin-V雙標：
磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時）PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。
Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合。因此細胞處于調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性

形態學觀察
1、普通光鏡下觀察：
1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失
2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色
3）直接用倒置顯微鏡觀察：
細胞體積變小，全面皺縮；凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。
2、透射電子顯微鏡觀察
凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。
細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
3、熒光顯微鏡
常用的熒光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等
Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
1）PI雙染色法基本原理
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。
DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。
碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
注意事項：細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

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細胞凋亡的分子生物學檢測方法:
細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

一、過氧化物酶標記測定法
原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。

(一)試劑配制
1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。
4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲*酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。
5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。
6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05％二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。
8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）

（二）實驗步驟
1、標本預處理：
（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進行操作。
（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。
（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。
2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。
4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。
5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。
6、 組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。
9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，后1次5min。
10、 于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。
11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。

（三）注意事項
一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

二、吖啶橙(簡稱AO)熒光染色法
（一）原理：吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一種熒光染料，激發峰492nm，熒光發射峰530nm(DNA)，640nm(RNA)，它與雙鏈DNA的結合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光(給502nm)激發下，細胞核發亮綠色熒光(約530nm)，核仁和胞質RNA發桔紅色熒光(＞580nm)。吖啶橙的陽離子也可以結合在蛋白質、多糖和膜上而發熒光，但細胞固定阻抑了這種結合，從而主要顯示DNA、RNA兩種核酸。

（二）試劑
1、AO貯備液：AO 50mg(分析純)，蒸餾水 50ml 、4℃冰箱保存4個月。Tris緩沖液：Tris 50mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 25mmol/L

2、AO工作液：將AO貯備液10:1用蒸餾水稀釋，再用Tris緩沖液將AO稀釋到8.5μg/ml的終濃度。

（三）操作步驟
1、取乙醇固定的細胞懸液，濃度為107/ml，1500r/min，5分鐘，棄乙醇。
2、加入2ml AO工作液，室溫染10分鐘。
3、滴在載玻片上，加緩沖甘油封片。
4、在熒光顯微鏡下用吸收波長405nm，發射波長530-640nm觀察。

結果：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

三、Hoechst33258染色
Hoechst33258為特異性DNA染料，，與A-T鍵結合，但在pH2.0環境下則優先與RNA結合，染色DNA時應調整染液的pH至7.0，這種染料不溶于磷酸緩沖液；所以配制時必須先以蒸餾水溶解配成儲存液在4℃中避光保存。
本方法是用于培養細胞、細胞涂片或細胞甩片。

（一）試劑及配制
(1)Hoechst33258貯存液：稱取Hoechst33258試劑1mg，用20ml蒸餾水溶解后，濾過，4℃避光保存。用時蒸餾水10倍稀釋成染色液。
(2) 0.01molPBS，pH7.2。
(3)封片液(pH5.5)：20mmol/L檸檬酸，50mmol/L 磷酸氫二鈉，50%甘油。
(4)細胞固定液：甲醇/冰乙酸(3:1)，現配。

（二）操作方法
(1)原代細胞培養、細胞學涂片或細胞甩片機制制備的單細胞片。
(2)細胞固定液4℃固定5min。
(3)蒸餾水稍洗后，點加Hoechst33258染色液，10min。
(4)蒸餾水洗片后，用濾紙沾去多余液體。
(5)封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

結果：在熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散、均勻熒光，壞死細胞不被Hoechst染色。出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光及明顯核形態變化，如果見到3個或3個以上的DNA熒光碎片被認為是凋亡細胞。

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四、甲基綠-派諾寧染色法
(一)原理
細胞凋亡和細胞壞死均可表現為細胞核固縮等細胞死亡形態，但兩者發生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內蛋白酶的激活，細胞質內常有mRNA表達的增強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程，細胞質內常有RNA的損失。根據這一特點，可應用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質內核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞。

(二)試劑及配制
1. 組織固定液：無水乙醇 600ml、氯仿 300ml、冰醋酸 100ml
2.甲基綠純化： 新購買的甲基綠需用氯仿進行純化處理以去除甲基紫。方法是將2％甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿20ml充分，使其內的甲基溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶比紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反復更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4℃保存。
3.染色液：甲基綠貯存液 5ml、5%派諾寧水溶液 1ml、蒸餾水 12ml、0.2mol/L乙酸鈉(pH4.8) 18ml，臨用前配制，濾紙過濾。

(三)操作方法
1.新鮮取材組織置固定液中4℃固定3-6h(或培養細胞、細胞學甩片固定10min)。
2.直接轉入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。
3.切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水。(細胞學涂片不用梯度酒精)
4.置染色液中室溫下染色約1h。
5.取出切片，不經水洗，用濾紙吸干多余染液。
6.插入丙酮中迅速分化。
7.轉入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。
8.二甲苯透明2-3次。
9.中性樹膠封固。

(四)結果
光學顯微鏡下凋亡細胞固縮，細胞核呈綠色或綠藍色著染，胞質呈紅紫色著染，壞死細胞只有固縮細胞核呈綠色著染。觀察時可用凋亡指數進行計數，即隨機選擇約10-20個視野(每張切片約1000-2500個細胞)，計數凋亡細胞百分率。