L-精氨酸（Arg）在多種代謝和生理過程中發揮重要作用，其濃度變化與病理過程密切相關。現有測量精氨酸的傳統方法及現有基因編碼的精氨酸熒光傳感器存在局限性，亟需開發新型傳感器。2025年1月21日，首都醫科大學基礎醫學院饒毅課題組在ACS Sensors期刊發表題為“Development of a Genetically Encoded Sensor for Arginine”的最新研究成果。研究開發了一種新的Arg探針——ArgS1，能實時監測哺乳動物細胞中的精氨酸水平，有助于研究精氨酸代謝機制及相關生理病理作用?；A醫學院博士研究生王純為第一作者，昌平實驗室咸逸副研究員與饒毅教授為并列通訊作者。
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MDA-MB-231細胞和ASS1過表達MDA-MB231細胞中ArgS1傳感器的熒光強度和響應
01 研究結果
1、 ArgS傳感器的設計與優化
大腸桿菌的artJ蛋白在結合精氨酸時會發生構象變化，基于這一特性，研究團隊將來自GRABDA2m的環狀置換綠色熒光蛋白（cpEGFP）嵌入artJ蛋白中，開發了一種基因編碼的精氨酸（Arg）熒光探針。研究人員首先在純化蛋白水平上篩選了cpEGFP的插入位點，并通過將探針與iSeroSnFR的膜靶向序列融合，篩選出兩種響應較好的探針ArgS0.1和ArgS0.2。隨后，團隊進一步優化了連接肽鄰近位點，最終篩選出響應值最佳的探針ArgS1。為了驗證探針的特異性，研究人員將ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1在大腸桿菌中表達并純化，測試了它們對精氨酸及其代謝物的響應。結果顯示，ArgS1對精氨酸的特異性最強，并且其響應表現出對pH的依賴性；此外，ArgS1對精氨酸相關代謝物的響應極其微弱，這充分說明它在檢測過程中受其他物質干擾的程度極小，具備較高的檢測準確性和可靠性。
圖1. ArgS傳感器的體外測量
2、Arg傳感器檢測HEK293T細胞細胞質和亞細胞器中Arg的變化
研究團隊在HEK293T細胞中表達了ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1三種探針，驗證其在哺乳動物細胞中檢測Arg的能力。三種探針均能響應Arg的增加，其中，ArgS1的動態范圍最大（3.3）。進一步測量ArgS1在細胞內的結合親和力，利用毛地黃皂苷透化細胞膜，并添加不同濃度的Arg進行原位滴定。結果顯示，ArgS1在HEK293T細胞質中的Kd值為64μM。此外，非結合對照探針ArgS1-C對1 mM Arg無響應，排除了非特異性信號干擾。接下來，在HEK293T細胞中表達ArgS1，并使用精氨酸酶抑制劑（AI1）和一氧化氮合酶抑制劑（L-NMMA）調控Arg濃度，以研究藥物干預對Arg水平的影響，發現AI1或AI1與L-NMMA聯合應用可顯著提高細胞內Arg水平，而單獨使用L-NMMA無此效果。這表明在HEK293T細胞中，精氨酸酶途徑在Arg降解中起主導作用，與轉錄組測序結果一致。研究團隊進一步驗證了探針在亞細胞器中的響應能力，將ArgS1和ArgS0.1分別靶向線粒體、內質網、溶酶體和細胞核。結果表明，ArgS探針能夠有效監測哺乳動物細胞質和亞細胞器中的Arg動態變化。
圖2. HEK293T細胞質中ArgS1傳感器對Arg濃度變化的響應
3、細胞外Arg缺失引起癌癥細胞內精氨酸水平降低
精氨酸饑餓療法正被研究作為治療ASS1缺陷型癌癥的潛在策略。以乳腺癌細胞系MDA-MB-231為例，該細胞不表達ASS1。研究團隊首先驗證了Arg剝奪對細胞活力的影響，發現剝奪24小時后，MDA-MB-231細胞活力顯著下降，而ASS1過表達可恢復細胞對Arg饑餓的耐受性。為實時監測細胞內Arg水平，團隊構建了穩定表達ArgS1的MDA-MB-231細胞系。結果顯示，Arg剝奪后，ArgS1的488/405比率及其衰減速率均顯著降低，表明細胞內Arg水平下降。此外，ASS1過表達組的488/405比率高于ASS1缺陷組，證實ASS1過表達可恢復Arg水平。為進一步排除非特異性信號干擾，團隊在MDA-MB-231細胞中表達了非結合對照探針ArgS1-C，其對1 mM Arg灌注無響應。這些結果表明，ArgS1探針能夠有效監測癌細胞中的Arg水平變化。
圖3. MDA-MB-231細胞中Arg的成像
02 結論
本研究成功開發了一種基因編碼的精氨酸傳感器ArgS1，具有高特異性、大動態范圍和適用于生理濃度的特點。ArgS1能夠在細胞質和亞細胞器中實時監測精氨酸濃度的變化，為精氨酸相關疾病的研究和治療提供了重要工具，特別是在癌癥治療中，ArgS1可用于評估精氨酸饑餓療法的效果，并篩選適合該療法的患者。