研究背景
N6-甲基腺苷（m6A）修飾是一種重要的轉錄后調節機制，也是真核生物中最豐富、最保守的RNA表觀遺傳修飾。之前的研究表明m6A修飾參與多種組織再生過程，包括肝臟再生。VIRMA是一種具有強大甲基化能力的m6A甲基轉移酶。然而，其在肝臟再生中的作用仍然知之甚少。近期，四川大學華西醫院曾勇教授、陳向征副研究員團隊在Acta Pharmaceutica Sinica B (IF 14.6)上發表文章“VIRMA-mediated SHQ1 m6A modification enhances liver regeneration through an HNRNPA2B1-dependent mechanism”，發現VIRMA通過調節m6A修飾在促進肝臟再生方面發揮著關鍵作用，為肝臟再生期間的表觀遺傳調節提供了有價值的見解。
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基因信息 Virma：Vir樣m6A甲基轉移酶相關蛋白；Shq1：H/ACA核糖核蛋白組裝因子
病毒產品 Lv-Virma、Lv-Shq1
質粒產品 Virma質粒、Shq1質粒、Shq1-MUT質粒
感染細胞 AML12細胞
WB實驗驗證慢病毒介導的VIRMA在AML12細胞過表達
結果展示
1. Virma影響AML12的增殖能力
作者發現ALPPS手術后肝臟再生期間VIRMA升高，ALPPS和CCl4動物模型中VIRMA敲除抑制肝臟再生，表明Virma在肝細胞增生和肝臟再生中的關鍵作用。之后作者評估了Virma敲低后AML12細胞的增殖能力，CCK-8增殖試驗、集落形成試驗和EdU標記實驗發現Virma敲減顯著抑制了AML12細胞的增殖活性。此外，作者使用慢病毒在AML12細胞中穩定過表達Virma，并進一步評估了其增殖能力，發現Virma過表達顯著增強AML12細胞的增殖，還對AML12細胞的凋亡過程產生顯著影響。流式細胞術分析顯示，Virma敲低增加了AML12細胞的細胞死亡率，而Virma的過表達則有效降低了細胞死亡率。這些結果表明Virma不僅在促進AML12細胞的增殖方面發揮著至關重要的作用，而且還對維持細胞生存發揮著保護作用。
圖1. VIRMA促進AML12細胞的增殖
2. SHQ1是VIRMA m6A修飾的下游靶點
鑒于VIRMA是m6A甲基轉移酶復合物的重要組成部分，作者進一步探索了VIRMA在促進肝臟再生方面的下游靶點。MeRIPseq發現Virma缺失主要影響肝臟再生過程中的DNA重組、細胞周期和細胞群繁殖等過程，并在此基礎上確定了Virma的19個潛在下游靶基因，其中Shq1和Adck2在ALPPS手術后上調，在Virma敲除后下降。為了識別Virma潛在的直接下游基因，作者進行了RIP實驗，并觀察到被VIRMA抗體拉下的產物中Shq1 mRNA顯著富集，但Adck2 mRNA沒有顯著富集。蛋白印記實驗顯示Virma-KO小鼠中SHQ1蛋白表達水平顯著降低，且體外實驗表明敲低VIRMA會降低AML12細胞中SHQ1蛋白表達水平，但過表達VIRMA會增加SHQ1水平。此外Virma敲除導致Shq1 mRNA的穩定性降低，而Virma過表達增強了Shq1 mRNA的穩定性，這些數據表明，VIRMA充當SHQ1的上游調節因子，通過穩定SHQ1的mRNA來調節SHQ1的表達。雙熒光素酶報告實驗表明Virma對Shq1表達的調節取決于m6A修飾。進一步研究發現SHQ1通過AKT激活依賴性機制促進細胞增生，而VIRMA的喪失通過抑制SHQ1表達來抑制細胞增殖。
圖2. SHQ1是VIRMA m6A修飾的下游靶點
3. VIRMA通過增強SHQ1表達促進肝臟再生
為了確認SHQ1是否是VIRMA在體內促進肝臟再生的主要因素，作者評估了SHQ1的引入是否可以挽救Virma敲除對肝臟再生的有害影響。發現過表達Shq1的小鼠中，Virma敲除引起的肝臟再生率降低顯著逆轉。此外SHQ1的過表達有效逆轉了Virma敲除導致的肝臟功能的血清標志物（包括ALT、AST和TBIL）升高。肝再生標志物Ki67、BrdU和p-H3S10的免疫組織化學分析表明，SHQ1的過表達有效逆轉了Virma敲除引起的這些標志物的減少。HE染色進一步證明SHQ1過表達有效地恢復了有絲分裂活性。總體而言，本研究發現在肝臟再生過程中，VIRMA通過促進其m6A修飾來上調SHQ1的表達。在這一機制中，HNRNPA2B1作為能夠識別和結合m6A修飾的Shq1 mRNA的“閱讀器”，進一步增強了Shq1 mRNA的穩定性，導致SHQ1蛋白表達水平增加。這些結果表明SHQ1表達的上調激活了PI3K/AKT信號途徑，這對于促進肝臟再生至關重要。
圖3. VIRMA通過增強SHQ1表達促進肝臟再生
實驗結論
本研究發現ALPPS手術和急性損傷后，m6A修飾與補償性肝再生之間密切相關。在肝臟再生的早期階段，肝臟中VIRMA表達的增加與肝細胞增生增加和細胞周期進程加速相關。在機制上VIRMA的缺失導致Shq1 mRNA的m6A修飾減少，導致其mRNA穩定性降低，隨后SHQ1表達下調。此外，SHQ1的下調會抑制PI3K/AKT途徑，從而抑制肝細胞增生并最終阻礙肝臟再生。這些發現揭示了VIRMA的新生物學功能，并為肝再生的潛在干預策略提供了新的見解。