肝臟是人體中最大的器官之一，是調節營養吸收和代謝的主要器官，能夠中和攝入的有毒化合物，并產生體內近50%的循環蛋白質。肝臟由多種細胞類型組成，其中占比最高的是功能多樣的肝細胞。
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肝臟作為重要的“解毒”器官，在執行日常功能時會受到各種代謝、病毒的侵害，可能會導致不同程度的肝損傷。長期損傷形成的纖維化疤痕破壞了肝臟的完整性，并且還會誘導門靜脈高血壓等其它疾病。在大多數肝臟疾病和藥物誘導的肝損傷(DILI)中，損傷始于肝細胞，同時也會激活其它類型細胞（如：KC和HSC）。因此，為了充分理解每種肝病的表型和損傷器官的機制，我們需要建立復雜的體外肝模型，以便于更好地進行肝臟相關的疾病和毒性研究。
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本篇文章基于Nature protocols【1】和Journal of hepatology【2】發表的兩篇文章，整理了人類誘導多能干細胞（human iPSCs）來源的肝臟類器官培養方案。
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圖1. 人iPSCs來源的肝類器官培養方案【2】
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細胞來源
Human iPSCs
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培養基配方
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iPSCs培養和傳代
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1.將100mm培養皿包被5ml 0.1%（w/v）的明膠，室溫靜置15min至明膠凝固。
2.在明膠上接種絲裂霉素處理過的MEFs細胞懸浮液，細胞數約為1.8×106個。放置在37℃，5%CO2的培養箱中培養至細胞匯合度70-80%時進行傳代。
3.吸去MEFs培養基，將iPSCs接種于明膠上，添加10ml iPSCs（I）培養基，放置在37℃，5%CO2的培養箱中培養3-5天。
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定向內胚層分化
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4.?在60mm培養皿中加入2ml Matrigel，室溫靜置2h并添加DMEM-F12培養基至完全沒過Matrigel。
5.?用不含Ca2+/Mg2+的PBS沖洗iPSCs后，加入300μl Accutase，37℃孵育3-4min。
6.?將消化下來的細胞懸液收集并90g離心5min，收集細胞沉淀并加入iPSCs（II）培養基，同時進行細胞計數。
7.?將iPSCs接種在Matrigel平板上，接種密度為1.5×106個/60mm平皿，接種后添加4ml iPSCs（II）培養基，放置在37℃，5%CO2的培養箱中過夜培養。
8.?接種后第二天，用DEs培養基進行換液，放置在37℃，5%CO2的培養箱中培養6天，每2天換液一次。
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肝內胚層分化
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9.?用HEs培養基進行換液，放置在37℃，5%低氧的培養箱中培養3天。
10.?用HEs（II）培養基進行換液，放置在37℃，5%低氧的培養箱中培養4天，之后轉移至常氧條件下培養8天，達到肝成熟。
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類器官培養
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11.?肝成熟后的9-12天，在單層肝細胞上會出現三維結構，此時將漂浮的囊泡狀細胞收集起來，加入Matrigel并放置在37℃條件下10min使Matrigel凝固。
12.?添加HM培養基并完全沒過Matrigel頂部，每3天更換培養基，每7天機械傳代一次類器官。
類器官擴增和分化
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13.?將HM培養基吸出，用PBS清洗后，加入EM培養基，放置在37℃，5%低氧的培養箱中培養4天進行類器官擴增。
14.?隨后用DM培養基進行換液，放置在37℃，5%CO2的培養箱中培養6天，完成進一步分化。
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圖2. 擴增培養基（EM）和分化培養基（DM）孵育后的肝類器官免疫熒光圖【2】
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肝類器官應用前景
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類器官是一種能夠進行體外更新和自組裝的模型，相比于傳統的二維(2D)細胞培養，類器官的生長環境更貼合生理條件。3D培養的肝類器官可以用于疾病建模，以便確定疾病的機制以及治療方法。研究表明，3D培養的iPSC來源的肝類器官比2D干細胞更易感染乙型肝炎病毒【3】。2019年Ouchi, R.et al.【4】利用iPSCs來源的肝類器官，在體外模擬了炎癥和纖維化，為進一步了解Wolman疾病打下了基礎。
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在藥物毒性驗證方面，肝類器官同樣發揮著重要的作用。對乙酰氨基酚是藥物引起肝衰竭的最常見來源，利用肝臟類器官可以實現藥物的肝毒性驗證，更適用于未來的藥物篩選和開發【5】。
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類器官作為一種研究模型，在發育生物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養技術建立過程中會面臨多種挑戰。為了更輕松更高效的建立類器官培養技術，歡迎各位掃碼加入類器官培養交流群，在這里會有專業的技術支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！
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參考文獻
【1】TAKEBE, Takanori, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.?Nature protocols, 2014, 9.2: 396-409.
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【2】MUN, Seon Ju, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.?Journal of hepatology, 2019, 71.5: 970-985.
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【3】Nie, Y. Z. et al.(2018). Recapitulation of hepatitis B virus–host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.?EBioMedicine,?35, 114-123.
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【4】Ouchi, R.?et al. (2019). Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids.?Cell metabolism,?30(2), 374-384.
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【5】Sgodda, M.?et al.?(2017). A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features.?Stem cells and development,?26(20), 1490-1504.
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