A：提前準備hPSC細胞、提前預冷冰盒及所需無菌吸頭、離心管；

B：分裝NovoMatrix基質膠：提前將基質膠放在4℃過夜融化，用預冷過的冰盒盛放并轉移到生物安全柜內，按照500μL/支分裝后凍存在-80℃冰箱，避免反復凍融；

C：配制干細胞鋪底液：使用預冷的hPSC完全培養基按照1:100（v/v）稀釋干細胞專用基質膠（Cat#NMS-G）;

D：準備hPSC完全培養基

E：配置各培養階段所需的分化培養基，配制好的完全培養基在使用前需要37℃預熱或平衡至室溫

提示：細胞因子種類及用量僅供參考，可根據實際反應體系進行調整

A、hPSC傳代培養（以6孔板為例）

（1）取1mL干細胞鋪底液加入一個孔中，搖晃均勻覆蓋皿底，置于37℃恒溫培養箱中處理1h；

（2）取出在hPSC完全培養基中維持培養且匯合度達到85%-90%的hPSC，吸出培養基，加入1mL D-PBS洗一次，吸出后加入1mL干細胞消化液，搖晃均勻，置于37℃恒溫培養箱中消化5min；

（3）消化完成后，加入1mL hPSC完全培養基，輕輕吹下細胞，轉移至15mL離心管中，離心1000rpm，3min；

（4）吸出鋪底的基質膠溶液，每個六孔板加入2mL hPSC完全培養基；

（5）去上清，加入1mL hPSC完全培養基重懸細胞，按1:6-1:10的比例傳代，并加入終濃度為5μM的Y-27632，輕輕晃勻，置于37℃恒溫培養箱中培養。

B、定型內胚層分化

（1）培養hPSC至接合密度為80%左右，去除孔中培養基并加入2mL內胚層分化培養基，培養72h;

Figure 1.誘導3天后細胞狀態

C、肝祖細胞

（1）去除內胚層分化培養基，加入2mL 肝祖分化培養基，培養24h后，應出現零散分布的局部細胞應出現凝聚現象，且每天增多，至第9-10天在培養體系中會出現少量的懸浮;

Figure 2.誘導9天后細胞狀態

（2）Day10：加入1mL 干細胞消化液，將孔中細胞團解離成單細胞;

D.肝祖細胞包埋與肝祖類器官培養

（1）包埋前，將NovoMatrix類器官專用基質膠（Cat#NMO-G-PF）在4℃下解凍過夜;

（2）在37℃培養箱中加熱24孔板;

（3）根據收集球體的數量，加入合適量基質膠使每40μL基質膠中含有3000-10000個左右的肝祖細胞，輕輕混勻;

注意：基質膠占比不低于70%

（4）按照24孔板每孔40μL種板，37℃倒置凝固20min;

（5）加入500μL的肝祖分化培養基培養，每三天更換一次培養基;

Figure 3.肝祖類器官形態圖

E.肝祖類器官誘導培養為肝實質類器官

（1）將肝祖類器官用干細胞消化液解離成單細胞，按照每孔10000~20000個細胞接種24孔板;

（2）在37℃培養箱中加熱24孔板;

（3）加入500μL的肝實質分化培養基培養，每三天更換一次培養基，后續可進行免疫熒光等鑒定;

Figure 4.肝實質類器官形態圖

近岸蛋白可提供科研級和GMP級hPSC誘導培養肝臟類器官所需細胞因子，高活性、低內毒素、高批間一致性；同時提供成體組織來源的肝臟類器官完全培養基，包括擴增培養基和分化培養基，助力肝臟類器官體外培養。

Measured by its ability to induce IL-11 secretion by Saos2 human osteosarcoma cells. The specific activity is ≥ 1.0 × 10⁶ IU/mg (QC verified).

Measured by its ability to induce SMAD signaling in 293-Activin A Res cells. The ED50 for this effect is 1-5 ng/mL.(QC verified).

Measured by its ability to induce Topflash reporter activity in HEK293T human embryonic kidney cells.The ED50 for this effect is 20-80 ng/ml(QC verified).