A：提前準(zhǔn)備hPSC細(xì)胞、提前預(yù)冷冰盒及所需無菌吸頭、離心管；

B：分裝NovoMatrix基質(zhì)膠：提前將基質(zhì)膠放在4℃過夜融化，用預(yù)冷過的冰盒盛放并轉(zhuǎn)移到生物安全柜內(nèi)，按照500μL/支分裝后凍存在-80℃冰箱，避免反復(fù)凍融；

C：配制干細(xì)胞鋪底液：使用預(yù)冷的hPSC完全培養(yǎng)基按照1:100（v/v）稀釋干細(xì)胞專用基質(zhì)膠（Cat#NMS-G）;

D：準(zhǔn)備hPSC完全培養(yǎng)基

E：配置各培養(yǎng)階段所需的分化培養(yǎng)基，配制好的完全培養(yǎng)基在使用前需要37℃預(yù)熱或平衡至室溫

提示：細(xì)胞因子種類及用量僅供參考，可根據(jù)實(shí)際反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整

A、hPSC傳代培養(yǎng)（以6孔板為例）

（1）取1mL干細(xì)胞鋪底液加入一個孔中，搖晃均勻覆蓋皿底，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中處理1h；

（2）取出在hPSC完全培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)且匯合度達(dá)到85%-90%的hPSC，吸出培養(yǎng)基，加入1mL D-PBS洗一次，吸出后加入1mL干細(xì)胞消化液，搖晃均勻，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化5min；

（3）消化完成后，加入1mL hPSC完全培養(yǎng)基，輕輕吹下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，離心1000rpm，3min；

（4）吸出鋪底的基質(zhì)膠溶液，每個六孔板加入2mL hPSC完全培養(yǎng)基；

（5）去上清，加入1mL hPSC完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:6-1:10的比例傳代，并加入終濃度為5μM的Y-27632，輕輕晃勻，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

B、定型內(nèi)胚層分化

（1）培養(yǎng)hPSC至接合密度為80%左右，去除孔中培養(yǎng)基并加入2mL內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h;

Figure 1.誘導(dǎo)3天后細(xì)胞狀態(tài)

C、肝祖細(xì)胞

（1）去除內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，加入2mL 肝祖分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，應(yīng)出現(xiàn)零散分布的局部細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，且每天增多，至第9-10天在培養(yǎng)體系中會出現(xiàn)少量的懸浮;

Figure 2.誘導(dǎo)9天后細(xì)胞狀態(tài)

（2）Day10：加入1mL 干細(xì)胞消化液，將孔中細(xì)胞團(tuán)解離成單細(xì)胞;

D.肝祖細(xì)胞包埋與肝祖類器官培養(yǎng)

（1）包埋前，將NovoMatrix類器官專用基質(zhì)膠（Cat#NMO-G-PF）在4℃下解凍過夜;

（2）在37℃培養(yǎng)箱中加熱24孔板;

（3）根據(jù)收集球體的數(shù)量，加入合適量基質(zhì)膠使每40μL基質(zhì)膠中含有3000-10000個左右的肝祖細(xì)胞，輕輕混勻;

注意：基質(zhì)膠占比不低于70%

（4）按照24孔板每孔40μL種板，37℃倒置凝固20min;

（5）加入500μL的肝祖分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天更換一次培養(yǎng)基;

Figure 3.肝祖類器官形態(tài)圖

E.肝祖類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)為肝實(shí)質(zhì)類器官

（1）將肝祖類器官用干細(xì)胞消化液解離成單細(xì)胞，按照每孔10000~20000個細(xì)胞接種24孔板;

（2）在37℃培養(yǎng)箱中加熱24孔板;

（3）加入500μL的肝實(shí)質(zhì)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天更換一次培養(yǎng)基，后續(xù)可進(jìn)行免疫熒光等鑒定;

Figure 4.肝實(shí)質(zhì)類器官形態(tài)圖

近岸蛋白可提供科研級和GMP級hPSC誘導(dǎo)培養(yǎng)肝臟類器官所需細(xì)胞因子，高活性、低內(nèi)毒素、高批間一致性；同時提供成體組織來源的肝臟類器官完全培養(yǎng)基，包括擴(kuò)增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，助力肝臟類器官體外培養(yǎng)。

Measured by its ability to induce IL-11 secretion by Saos2 human osteosarcoma cells. The specific activity is ≥ 1.0 × 10⁶ IU/mg (QC verified).

Measured by its ability to induce SMAD signaling in 293-Activin A Res cells. The ED50 for this effect is 1-5 ng/mL.(QC verified).

Measured by its ability to induce Topflash reporter activity in HEK293T human embryonic kidney cells.The ED50 for this effect is 20-80 ng/ml(QC verified).