破骨細胞誘導分化機制
破骨細胞是一種獨特的多核細胞，源自造血干細胞分化而來的巨噬細胞，專門負責骨吸收過程。RANK L/RANK/OPG信號通路是調控破骨細胞分化的核心樞紐，可精密調控破骨細胞與成骨細胞的活性平衡，確保骨骼穩態。[1]
RANK L/RANK/OPG信號通路在誘導破骨細胞活化和失活中的調控作用
核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANK L）被認為是促進破骨細胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可誘導RANK在破骨細胞前體的細胞膜上表達，進而使表達RANK的破骨前體細胞和RANK L結合并產生效應，誘導破骨細胞分化。
破骨細胞在體內數量少，僅占分離細胞0.8%-1.2%，在體外分離培養比較困難，現在破骨細胞主要采用誘導法，常用的是骨髓單核細胞誘導法和RAW264.7細胞系誘導法。
破骨細胞誘導實驗方法及注意事項
骨髓單核細胞誘導法[2]
01選用8-12周齡雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法處理后，浸泡于50mL 75%乙醇中5分鐘進行消毒。
02 無菌操作下完整取下小鼠后肢，剔除股骨和脛骨上多余的皮膚與肌肉組織，隨后將骨頭置于10mL含有2%青霉素-鏈霉素的PBS溶液（4℃預冷）中。
03 分離脛骨和股骨，用2mL含2%青霉素-鏈霉素的PBS溶液清洗兩次，每次5分鐘。
注意：小鼠骨髓單核細胞提取過程全程注意無菌操作，避免污染。
04 用10mL注射器（配備25G針頭）向骨頭兩端注入α-MEM，將骨髓細胞沖洗出來，然后將這些細胞通過70μm細胞篩網過濾到一個50mL的離心管中。反復沖洗直至骨髓腔內不再有明顯的紅色殘留。每塊骨使用約8mL的α-MEM進行沖洗，以收集細胞，并將所有骨髓細胞在室溫下臨時保存于50mL的錐形管中。
注意：可用潤洗液提前將細胞篩網、50mL離心管進行潤洗，以減少粘附，提高細胞收率。
05 室溫下400×g離心5分鐘，棄去上清液，加入3mL紅細胞裂解緩沖液，室溫靜置2-3分鐘裂解紅細胞。
06 加入5mL含10% FBS的常溫α-MEM培養基終止裂解，300×g 離心3分鐘，棄上清。
07 將細胞重懸于20mL含20-50ng/mL M-CSF (CB34)的完全培養基中，轉移至兩個10cm培養皿，在37℃、5% CO?的培養箱中過夜培養。
08 12小時后，收集未貼壁的細胞，接種至10cm培養皿中繼續培養，培養基為含10% FBS和20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培養基。
注意：細胞種板密度過高，或M-CSF濃度添加太高，可能導致細胞增殖過快，影響后續破骨誘導。
09 每隔一天換液，培養2-3天，直至貼壁細胞達到80%-90%融合。
10 提前在24孔板中放置蓋玻片，收獲骨髓細胞，以終濃度為1.6-2.0×106 cells/mL、每孔0.5mL的量接種到放有蓋玻片的24孔板中，培養基為含20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培養基。
11 12小時后，更換為含有20-50ng/mL M-CSF (CB34)和50-100ng/mL RANK L (C28A)的10% FBS的α-MEM培養基，此后每隔一天換液，誘導6-8天，期間破骨細胞在第4-5天形成。
12 按照TRAP染色試劑盒說明書對24孔板中的細胞進行染色，在顯微鏡下觀察，具有三個或更多細胞核且呈深紅色至紫色的TRAP陽性細胞即為破骨細胞。
破骨細胞（Trap染色）
注意：破骨細胞誘導成熟后，請盡快進行Trap染色，24h后破骨細胞會破碎。
RAW264.7細胞系誘導法
01 細胞培養：常規培養于含10%FBS的DMEM中，置于37℃、5%CO2的加濕培養箱中，每隔一天更換培養基。當細胞匯合度達到80%-90%時，用移液器或巴氏管將細胞輕輕吹下，避免使用胰酶消化，收集細胞后以1:2~1:3的比例傳代。
注意：細胞培養時，如果鏡下較多細胞出現偽足時，細胞整體狀態可能不好，這時的細胞不適合用于誘導破骨。
02 用含10%FBS的α-MEM培養基將RAW264.7細胞制成細胞懸液，以2×104 cells/孔的密度接種于24孔板中。
注意：根據相關文獻報道，該細胞濃度下破骨誘導程度最高，但不同實驗室培養條件及細胞亞型均可能有差異，因此在有條件的情況下建進行最佳種板密度的摸索，以獲得最佳破骨細胞誘導效果。
03 細胞接種12h后，加入100-150ng/mL RANK L (C28A)。
注意：此處100`150ng/mL RANK L，是統計大部分客戶實際培養使用的濃度，不同實驗室RAW264.7細胞來源、亞型、種板密度等。
04 每3天更換培養基，并同時補加20-100ng/mL RANK L。
05 較為明顯的多核破骨細胞將在分化培養4天后開始出現，并在第5天至第6天逐漸變得豐富。
06 進行TRAP染色，鑒定破骨細胞。
近岸蛋白提供高活性、高批間一致性的重組M-CSF和RANK L蛋白，助您穩定高效誘導破骨細胞。
產品數據
高活性重組M-CSF和RANK L蛋白
Measured in a cell proliferation assay using M-NFS-60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 0.04-0.2 ng/ml.
Measured by its ability to induce osteoclast differentiation of RAW 264.7 mouse monocyte/macrophage cells.（RANK L：Cat.No.:C28A）
參考
- ^Aidos et. Root Resorption Classifications: A Narrative Review and a Clinical Aid Proposal for Routine Assessment. European Endodontic. 2018.
- ^Zhuang, X. and G. Hu, In vitro Osteoclastogenesis Assays Using Primary Mouse Bone Marrow Cells. Bio-protocol, 2018. 8(11): p. e2875-e2875.