mRNA疫苗生產過程主要包括質粒獲取、mRNA原液制備、LNP包封等環節。mRNA原液制備是生產過程中的重要環節，原液的質量控制是決定疫苗量產的關鍵因素。為規范和指導mRNA原料質量，2022年2月23日美國藥典（USP）發布了關于“mRNA疫苗質量分析方法”的指南草案。今年5月31日我國國家藥監局藥審中心（CDE）也發布了”體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）”用于強化mRNA類藥品的質量標準。這些指導原則明確對mRNA不同區域結構的完整性提出要求，如5‘-Cap帽或帽類似物結構、poly(A)長度及分布等。
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mRNA的完整性確保了蛋白質的準確翻譯，5’-Cap帽結構修飾[1]可以保護mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促進翻譯的起始、降低免疫原性。按照GMP標準條件，每生產一批mRNA都需要對mRNA的加帽率、顏色、雜質、內毒素含量等進行嚴格測定，確保出廠的mRNA完整、純凈、高質量。mRNA加帽率檢測是mRNA質量控制的重要指標。
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圖1. 真核生物5’-Cap帽結構甲基化修飾情況[1]
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在真核細胞中，mRNA的加帽反應主要包括4步[2]：1）RNA三磷酸腺苷酶催化新生mRNA 5’-三磷酸水解為5’-二磷酸結構；2）鳥苷酰轉移酶將GMP轉移到5‘-二磷酸結構中；3)RNA甲基轉移酶對鳥嘌呤N7位點進行甲基化修飾，即產生Cap0帽子結構；4）在mRNA第一位核苷酸的2‘-羥基位被RNA甲基轉移酶進一步進行甲基化修飾即可產生Cap1帽子結構。
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圖2. 真核細胞mRNA加帽過程示意圖[2]
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mRNA加帽率檢測
近岸蛋白針對mRNA加帽率的檢測服務包含探針設計及合成、樣本制備、LC-MS上機、檢測報告出具等環節的全流程服務，同時可根據客戶具體需求，選擇僅LC-MS上機和檢測報告出具服務。方式靈活，服務周期短，檢測質量可靠。
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1. 檢測原理
利用一種特殊裂解探針法進行mRNA加帽率分析。通過設計mRNA 5’端互補探針，退火形成RNA/DNA雜合鏈，利用RNaseH在特定位置從mRNA的5'末端切割短序列，并用液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）分析獲得加帽率。
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2. 樣品前處理
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此處理首先通過設計mRNA 5’端裂解探針，待探針與目標mRNA形成DNA/RNA雜交雙鏈后，引導RNase H在特定位置切割mRNA。再用鏈霉親和素磁珠捕獲與切割的片段配對的生物素標記的切割探針，將切割片段分離。最后更換溶劑條件，從探針中釋放結合的mRNA，含有裂解產物與探針的上清液用于LC-MS分析。
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圖3. mRNA加帽率檢測儀器 Agilent 6545 Q-TOF
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上機檢測過程：
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圖 4. 總離子流色譜圖
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圖 5. 目標峰原始質譜圖
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圖 6. 去卷積質譜圖
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3. mRNA 加帽率計算
通過以上檢測，根據理論分子量在LC-MS結果中匹配對應的Uncapped triphos、Diphos 、G Cap、Cap0、 Cap1成分并計算峰面積占比。
Cap1加帽率=Cap1峰面積占比，Cap加帽率=Cap0峰面積占比+Cap1峰面積占比。
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結果示例
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近岸蛋白mRNA原料/服務一站式解決方案：
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參考文獻
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[1] SHANMUGASUNDARAM M, SENTHILVELAN A, KORE A R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines [J]. Chem Rec, 2022: e202200005.
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[2] MUTTACH F, MUTHMANN N, RENTMEISTER A. Synthetic mRNA capping [J]. Beilstein J Org Chem, 2017, 13: 2819-32.
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關于近岸蛋白
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