新冠疫情快速蔓延，對全球公共衛生安全造成了巨大的威脅，接種安全、有效的新冠疫苗是當下人們的迫切需求。截至2021年7月，全球共有19款新冠疫苗被批準上市，種類包括滅活疫苗、mRNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白亞單位疫苗和減毒活疫苗。另外，有128款疫苗已進入臨床實驗階段，其中有11款是DNA疫苗。
DNA疫苗具有易于設計和量產、生產成本低、性質穩定等優點，對比傳統類型的疫苗存在明顯優勢。此外，根據新冠DNA疫苗臨床試驗發表的數據，DNA疫苗能夠很好兼顧有效性與安全性，是未來疫苗研發新趨勢，因此對新型新冠DNA疫苗的研發仍在火熱進行中。
2021年5月27日，Kit Man Chai等人在《PLOS Neglected Tropical Diseases》期刊發表了文章《DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsters》，研究者通過質粒構建得到6種不同的DNA候選疫苗，并對這些候選疫苗的有效性和安全性進行了系統驗證，最后通過動物實驗證明了接種DNA疫苗可有效防護新冠病毒感染。這項研究的詳細解讀如下：
候選DNA疫苗的質粒構建與抗原表達
圖1.候選DNA疫苗的質粒構建與抗原表達
實驗流程如圖圖1.所示。研究者首先對SARS-CoV和SARS-CoV-2各構建了一種表達全長S蛋白的質粒。此外，由于抗原表達與疫苗效力密切相關，研究者又對SARS-CoV-2設計了4種不同的Spike基因片段，共得到6種不同的候選疫苗，它們分別為：
1. pSARS-S：表達SARS-CoV全長S蛋白的質粒；
2. pSARS2-S：表達SARS-CoV-2全長S蛋白的質粒；
3. ptSARS2-S：信號肽為組織纖溶酶原激活(tPA)前導序列的SARS-CoV-2全長S蛋白表達質粒；
4. ptRBD：信號肽為tPA前導序列的SARS-CoV-2 RBD表達質粒，RBD表達片段為aa319-aa541；
5. ptRBDTM：信號肽為tPA前導序列的SARS-CoV-2 RBD至跨膜區表達質粒，表達區間片段為aa319-aa1236；
6. ptSdTM：信號肽為tPA前導序列的SARS-CoV-2跨膜結構域缺失的表達質粒，表達區間為aa13-aa1213。
圖2. Spike蛋白的蛋白質印跡分析
數據顯示（圖2）pSARS-S與pSARS2-S皆可在相應的分子量處檢測到全長S蛋白。ptSARS2-S、ptRBDTM和ptSdTM變體的表達水平相似，ptRBD的表達水平最高。
候選疫苗的篩選
圖3. 候選DNA疫苗的驗證方法
1. 評估候選疫苗的有效性與長效性
實驗結果顯示，pSARS-S和pSARS2-S免疫動物的血清均可識別SARS-CoV-2的全長S區，S2區和RBD區，且IgG抗體滴度相近，但只有pSARS2-S可以引起高水平中和反應（圖4.）
此外，為進一步驗證pSARS2-S免疫效果，研究者還使用了中和抗體滴度檢測試劑盒對血清樣本中抗體對ACE2結合RBD的抑制能力進行了評估。結果表明 pSARS2-S免疫可以誘導競爭性抗體，有效地阻斷新型冠狀病毒RBD與ACE2受體的結合。
圖4. 接種pSARS-S和pSARS2-S疫苗免疫小鼠后的抗體反應
研究者還對比了不同候選DNA疫苗的免疫原性，實驗結果顯示，對全長S蛋白的抗體滴度ptSARS2-S＞ptRBD＞ptSdTM＞ptRBDTM，對RBD的抗體滴度ptRBD＞ptSARS2-S＞ptSdTM＞ptRBDTM。這些不同的變體并沒有誘導比pSARS2-S更高的中和抗體水平（圖5）。
圖.5. 接種SARS-CoV-2不同變體疫苗免疫小鼠后的抗體反應
另外，實驗結果顯示在小鼠免疫20周后血清中全長S蛋白的IgG滴度無明顯變化，中和抗體滴度降幅約18.6%，這意味著pSARS2-S免疫可對新冠狀病毒產生了持久的體液應答。
2. 評估疫苗的安全性
根據相關研究報道，Th2細胞反應相較于Th1的免疫反應具有更高的疫苗相關性呼吸道疾?。╒AERD）的風險，這意味著偏向Th1的免疫反應所產生的副作用風險可能較低。Th1細胞反應會產生炎性細胞因子(IFN-γ)，而Th2細胞反應可產生細胞因子IL-5和IL-13。研究者通過ELISA方法檢測pSARS2-S疫苗注射后小鼠血清中細胞因子IFN-γ、IL-5和IL-13的含量，結果發現血清中檢測到的子IFN-γ的含量遠高于IL-5和IL-13的含量，這意味著注射pSARS2-S DNA疫苗可產生偏向于Th1細胞反應。
綜上所述，pSARS2-S疫苗是合適的候選疫苗，可誘導體內產生特異性抗體和中和抗體，并且具有保護效力時間長、安全性好等特點。
pSARS2-S疫苗對SARS-CoV-2的保護效果
圖6. DNA疫苗動物模型實驗流程
圖7. 活病毒攻擊三天后檢測倉鼠肺中的病毒RNA拷貝數和抗體滴度
總結
在對新冠疫苗火熱研發的同時，我們也要關注到新冠病毒不斷地在進行新的突變及流行，對疫苗的有效性已經構成了逾加嚴峻的挑戰，因此研究者也需要對突變株疫苗投入更多的研究。
在本研究候選疫苗有效性評估過程中，研究者采用ACROBiossystems提供的中和抗體滴度檢測試劑盒（Cat.No.TAS-K022）評估血清樣本中抗體對ACE2結合RBD的抑制能力,所得結果與CPE方法檢測中和抗體和對SARS-CoV- 2 RBD病毒的ELISA滴度結果一致。
檢測原理：
試劑盒應用競爭ELISA方法。樣本中的中和抗體與微孔板上固定的Human ACE2 Protein競爭結合HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike，在450nm處測定樣本吸光度值（OD450nm），樣本OD450nm與樣本中中和抗體的含量呈負相關。
產品特點：
> 操作簡單，方便可靠
> 可同時檢測90+樣本
應用場景：
可用于新冠疫苗的研究，血清樣本中的中和抗體進行檢測等。
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驗證數據
圖8. TAS-K022 與 FDA 批準的 ELISA 試劑盒的相關性分析
經實驗驗證，使用上述ELISA試劑盒檢測接種疫苗的血清樣本對Wild type和B.1.1.7變異株的中和能力接近，但對B.1.351和P.1毒株的中和能力明顯下降（圖9）。
圖9. 新型冠狀病毒中和抗體滴度檢測試劑盒,包含WT-RBD（Cat. No. RAS-N022）、B.1.1.7 RBD（Cat. No. RAS-N028）、B.1.351 RBD（Cat. No. RAS-N031）、P.1 RBD（Cat. No. RAS-N034）、B.1.1.7 Spike（Cat. No. RAS-N036），B.1.351 Spike（Cat. No. RAS-N037）和P.1 Spike（Cat. No. RAS-N038），檢測56份接種疫苗后的血清樣本中的中和抗體，以研究疫苗對SARS-CoV-2相關變異株（VOC）的療效。
參考文獻：
1. https://covid19.trackvaccines.org/
2. https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html
3. DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsterss（May 27, 2021）https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009374
4. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines(June 15, 2020)https://doi.org/10.4049/jimmunol.1900517
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