胃是一個肌肉器官，在食物儲存和消化中起著重要作用。人的胃包含兩個主要區域:包含胃底（fundic）上皮的胃體（corpus）和胃竇（antrum）。每一個區域都具有不同的細胞類型和功能，因此都可以作為獨特的發育和疾病研究對象。
?
?
人源胃類器官（hGOs）的培養像傳統的2D細胞培養一樣，可以進行傳代、冷凍和復蘇；并且在長期保持基因組穩定性的同時，可以保留原始組織的特征。因此，構建胃類器官可以回答從基礎科學到臨床轉化的各種問題。我們可以利用這一工具，模擬體內的器官發育、也可以用于研究幽門螺旋桿菌感染機制。此外，利用CRISPR/Cas9技術已經成功實現類器官的疾病建模，人類正在使用這一模型，揭開胃部疾病的神秘面紗。
?
?
體外3D培養胃類器官的步驟比較復雜，小編在這里整理hPSCs來源的細胞分離及胃類器官培養、擴增的步驟，改編自BRODA等人描述的方法【1】。
?
?
?
?
圖1. 人胃的結構，以及由胃底（fundic）和胃竇（antrum）構成的類器官hFGOs和hAGOs【2】
?
?
所需試劑：
?
表1. hGOs培養所需的培養基
?
?
?
hPSCs細胞消化并傳代
?
1.將hPSCs培養至融合度約為75–85%，且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
2.向每個孔中加入1 ml Accutase，并將培養皿放回37℃，5% CO2的組織培養箱中，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式解離并漂浮(通常需要7-10分鐘)。
3.向每個孔中加入5ml的DMEM/F12，以充分稀釋Accutase。
4.將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min。
5.吸出上清，并進行細胞計數，同時在24孔板的每孔滴加500 μl冷的Matrigel，室溫下靜置使其凝固。
6.以300,000 ± 50,000個細胞/孔的數量接種在已包被Matrigel的24孔板中，每孔加入500μl mTeSR1（含有10 μM ROCK inhibitor Y-27632）。
7.將24孔板放置在37℃，5% CO2的組織培養箱中孵育24h。
8.在顯微鏡下觀察狀態，當單層的hPSCs融合度達到75-90%時，記為第0天。
?
hPSCs分化為人DE（第0-2天）
?
9.吸出mTeSR1培養基，加入DE生成培養基繼續培養48h，每24h換液一次（按照表格中的時間節點進行配制）。在分化過程的第一天和第二天，可以觀察到大量漂浮的細胞碎片，但仍具有連接細胞的網狀結構。
10.分化第二天后，單層細胞融合度可以達到95–100%。
?
后前腸球狀體的自發出芽（第3-5天）
?
11.吸出培養基，加入球狀體生成培養基繼續培養48h，每24h換液一次（按照表格中的時間節點進行配制）。
12.在第4天可以看到在孔表面有明顯的球體生成前的3D結構。
13.由于第5天的培養基中有添加RA，因此需要關閉生物安全柜的燈，并用錫箔紙包裹培養基和RA管，以防止過度曝光。此時可以觀察到有大量出芽結構的3D球體，和少量漂浮的球狀細胞團。
14.第6天，可以觀察到培養基中漂浮著大量的后前腸球狀體。
15.在顯微鏡下小心地吸出后前腸球狀體，并收集到微量離心管中。
?
球狀體發育成hAGOs或hFGOs(第6-20天)
?
16.在4℃條件下過夜解凍Matrigel。
17.將裝有后前腸球狀體的微量離心管直立放置在管架上約5min，利用重力將球狀體沉降在底部，此時不需要離心。
18.盡可能多地去除上層培養基，將350 μl冷的Matrigel快速加入到含有球狀體的微量離心管中，快速吹打混勻，注意避免引入氣泡。
19.吸取50 μl懸浮液，接種到24孔板的孔中心。保持移液器吸頭稍微高出孔底，并確保移液時不會接觸孔壁。
20.將培養皿放入組織培養箱中孵育10-15min，使Matrigel完全固化。然后向每個孔中添加500 μl hGOs形成培養基，確保每個孔中的Matrigel都被培養基覆蓋。
21.當培養基中的酚紅變黃，或當培養方案要求改變生長因子時（以先發生者為準），每4天更換一次 hGOs形成培養基，直到第20天。
?
hGOs傳代以實現持續增長
?
22.在第20天左右，通過將hGOs重新包埋在新鮮的Matrigel中，來降低每個孔中hGOs的密度。
23.在顯微鏡下觀察肺類器官，為了確保最佳生長狀態，每個孔應包含約 500 個類器官。
24.吸出孔內的培養基，加入少量DMEM/F12培養基。
25.在立體顯微鏡下，使用解剖刀將嵌入hGOs的Matrigel切割成薄片，每個切片包含五到十個hGOs。盡量避免直接切割hGOs，而是切割周圍的Matrigel，當然大多數被切割的hGOs會重新形成完整的內腔并繼續生長。
26.重復步驟16-21進行hGOs傳代培養。
?
?
成功培養出的hGOs可以作為研究胃生理學、胃疾病生理學和藥物開發的有力模型。
?
?
類器官作為一種研究模型，在發育生物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養技術建立過程中會面臨多種挑戰。為了更輕松更高效的建立類器官培養技術，歡迎各位掃碼加入類器官培養交流群，在這里會有專業的技術支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！
?
?
?
類器官培養交流群
?
?
?
推薦產品-胃類器官培養
?
|
貨號 |
產品名稱 |
?
?
?
?
相關產品：
?
?
|
貨號 |
產品名稱 |
?
?
?
?
參考文獻
?
【1】BRODA, Taylor R.; MCCRACKEN, Kyle W.; WELLS, James M. Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature protocols, 2019, 14.1: 28-50.
【2】 SEIDLITZ, Therese; KOO, Bon-Kyoung; STANGE, Daniel E. Gastric organoids—an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation, 2021, 28.1: 68-83.
蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
詳詢www.novoprotein.com.cn或致電400-600-0940。