肝細胞癌 (HCC) 是最常見的肝癌類型，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）在內的多種致病因素均可促進肝癌的發生發展，但到目前為止，肝癌的治療手段十分有限。最近報道表明，膳食膽固醇或從頭合成的膽固醇可通過合成膽汁酸(BAs)促進HCC發生。線粒體膽固醇主要通過甾體合成急性調節蛋白1（STARD1）進行調控，但其對HCC發展的作用尚不清楚。巴塞羅那生物醫學研究所Jose C. Fernandez-Checa研究團隊研究報道了STARD1刺激膽汁酸產生，進而促進NASH向HCC發展。相關成果發表于《Journal of Hepatology》。

NASH 驅動的HCC患者STARD1 表達增加和膽汁酸（BA）水平異常

盡管肝臟中STARD1基礎表達較低，但在NASH患者中STARD1表達上調，而在單純脂肪變性的受試者中無變化。STARD1在NASH驅動的HCC患者中尚未被探討，基于此，該研究對NASH驅動的HCC患者STARD1的表達進行檢測分析。結果顯示，與對照組相比，NASH驅動的HCC患者肝臟中STAR基因轉錄水平和STARD1蛋白水平增加。肝切片免疫組化顯示STARD1染色增強，且肝臟游離膽固醇水平升高。

此外，肝癌樣本中HMGCS、HMGCR和SREBP2（膽固醇穩態的主要轉錄因子）表達增加。盡管SREBP2受到膽固醇負反饋調控，但本研究探討了膽固醇升高同時伴隨 SREBP2 激活與TNFR1-Caspase-2-S1P-SREBP2 軸觸發的難治性反饋回路有關。qPCR結果顯示HCC患者CASP-2和MBPTS1 (S1P)表達增加，同時HIF1A和靶基因（PDK1、SLC2A1（Glut 1）、SLC2A3（Glut 3）和 SLC25A11（2-OGC））表達增加，這些基因可以調節HCC中線粒體GSH穩態。

接下來本研究檢測了HCC患者肝臟BA水平。與對照組相比，HCC患者肝臟總BA水平增加2倍，這與CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1、CYP7A1、CYP27A1表達增加一致，這表明BA合成的經典和替代途徑被激活。

圖1. NASH驅動的HCC患者STARD1表達增加

膽固醇促進NASH驅動的HCC小鼠疾病進展并誘導STARD1表達

盡管越來越多的證據表明膽固醇與HCC發展有關，但也有研究表明膽固醇在HCC中具有抑制腫瘤作用。鑒于單獨高脂飲食（HFD）不會誘導NASH以及二乙基亞硝胺 (DEN) 聯合HFD 喂養不能完全模擬NASH 驅動的HCC，本研究通過補充膽固醇的HFD飲食（HFHC）聯合DEN預處理建立飲食 NASH 驅動的HCC小鼠模型。這種飲食已被證明會誘發NASH。實驗結果表明與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶 (ALT) 水平更高，同時肝臟膽固醇含量增加和Hmgcr表達降低。脂肪變性程度和TG水平在DEN+HFD和DEN+HFHC小鼠之間相似，但與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠肝纖維化更為嚴重。

此外，DEN+HFHC小鼠肝臟切片顯示游離膽固醇水平升高，線粒體中也存在游離膽固醇。Tnfa 和 Ccl2表達升高表明，DEN+HFHC組肝臟炎癥增加。重要的是，喂養24周后DEN+HFD 小鼠出現腫瘤變化，但DEN+HFHC小鼠腫瘤數量和最大面積變化更大，喂養32周后腫瘤數量和最大面積進一步增加。腫瘤負荷增加了血清Afp水平，尤其是在DEN+HFHC組，并且這Afp和Yap（HCC標記物）表達升高。同時DEN+HFHC誘導肝臟Stard1表達，Stard1在HCC腫瘤中優先表達。與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠中與腫瘤發生（Gpc3、Ly6d和Golm1）、細胞粘附和相互作用（Birc5、Cd44和Lyve1）以及細胞增殖（Mki67）相關的標記物表達增加。

為了進一步確定膽固醇在NASH驅動HCC中的作用，本研究采用Ezetimibe（EZE）進行干預，EZE可阻止腸道吸收膽固醇，盡管其在臨床NASH中的作用尚不明確，但其在DEN+HFHC驅動的HCC中干預效果已被證實。EZE干預DEN+HFHC小鼠模型后，肝臟膽固醇、相關基因表達水平（Hmgcr 和 Hmgcs1）、肝纖維化程度等等均得到改善。由此進一步說明，膳食膽固醇可以促進NASH驅動HCC的發展。

圖 2. HFHC喂養促進DEN處理的野生型小鼠NASH驅動的HCC發展

肝細胞STARD1 缺失可減弱NASH驅動的HCC

為了探討STARD1在NASH驅動HCC中的作用，本研究構建了肝臟特異Stard1敲除小鼠(Stard1^△Hep)評價NASH驅動HCC的易感性。MUP-uPA小鼠肝細胞中STARD1缺失，該動物是一種內源性慢性內質網應激模型，其特征是尿激酶纖溶酶原激活劑（uPA）表達，通過內質網應激和過度喂養協同作用發展為肝癌。將MUP-uPA小鼠與Stard1^△Hep小鼠雜交繁育MUP-uPA-Stard1^△Hep小鼠并采用HFHC飲食。與MUP-uPA-Stard1^f/f小鼠相比，MUP-uPA-Stard1^△Hep小鼠表現出肝臟Stard1表達顯著降低。HFHC飲食喂養MUP-uPA-Stard1^f/f小鼠26周會導致肝臟腫瘤發展，但MUP-uPA-Stard1^△Hep小鼠腫瘤數量和最大面積顯著減少。同時血清Afp水平降低和參與纖維化（Col1a1和Acta2）和炎癥（Il6和Il1b）的基因表達降低，以及腫瘤標記物（Afp、Cd44和Ly6d）水平降低。有趣的是， Stard1敲除并不影響MUP-uPA-STARD1^△Hep小鼠內質網應激標記物的表達，表明在NASH驅動的HCC模型中，Stard1缺失的抑癌作用與內質網應激無關。

圖3. MUP-uPA小鼠肝細胞Stard1缺失減弱了小鼠中NASH驅動的HCC

此外，對Stard1^△Hep小鼠進行DEN干預，然后進行HFHC飲食24周。與MUP-uPA模型相似，DEN處理的Stard1^△Hep小鼠對HFHC介導的HCC發展具有相對抵抗力，表現出腫瘤多樣性和最大面積的降低、血清Afp水平降低。Stard1^△Hep小鼠腫瘤Yap和Afp表達降低和腫瘤標記物mRNA水平降低，而炎癥相關基因沒有變化。在DEN+HFHC處理的Stard1^△Hep小鼠中內質網應激標記物表達不變。因此，這些結果說明STARD1在NASH驅動HCC中獨立于內質網應激的關鍵作用。

圖 4. Stard1^△Hep小鼠對DEN+HFHC誘導的HCC不太敏感

STARD1過表達加劇DEN+HFHC飲食驅動的 HCC

為了進一步確證STARD1在NASH驅動HCC中的作用，在DEN+HFHC野生小鼠處死前5周注射攜帶Stard1 cDNA腺病毒來過表達Stard1（AD-Stard1）。與注射空白對照載體小鼠（AD-對照）相比，AD-Stard1組肝臟Stard1表達（mRNA和蛋白水平）增加15倍。這一結果增強了DEN+HFHC肝臟腫瘤多樣性。在AD-Stard1組中，HCC標志物（Afp、Yap）在腫瘤中的表達程度更高。此外，腫瘤標志物（Afp、Yap、Golm1 或 Krt19）表達、炎癥相關和缺氧調節基因表達增強。AD-Stard1肝臟氧化應激顯著高于AD-對照組。STARD1促腫瘤作用需要飲食中添加膽固醇（HC），在DEN+常規飲食喂養的小鼠或單獨喂養HC 24周的小鼠中，STARD1過表達不會導致HCC發生?？偟膩碚f，STARD1和膳食膽固醇協同促進HCC發展。

圖5. Stard1過表達增加DEN+HFHC驅動的HCC

STARD1調節BA水平

鑒于BAs與NASH進展和HCC發展有關，本研究對STARD1是否調節NASH驅動HCC中肝臟BAs水平進行研究。對AD-Stard1和Stard1^△Hep小鼠肝臟BAs進行質譜分析。實驗結果表明與AD對照組小鼠相比，AD-Stard1小鼠肝臟中BA總含量增加，如βMCA和CA及其牛磺結合衍生物Tα/βMCA和TCA水平增加，其水平比去氧膽酸（TUDCA）、?；侨パ跄懰幔═CDCA））高1個數量級。與Stard1^f/fmice相比，Stard1^△Hep小鼠總肝BA水平顯著降低，TCA、bMCA和CA水平較低。與MUP-uPA-Stard^f/f小鼠相比，在MUP-uPA-Stard1^△Hep小鼠中觀察到類似的βMCA、Tα/βMCs和TCA水平降低。但在AD-Stard1或Stard1^△Hep小鼠中，替代途徑中BA合成的中間產物氧化甾醇24S-羥基膽固醇（24S-OH-Chol）和27-羥基膽固醇（27-OH-Chol）水平沒有變化。有趣的是，AD-Stard1小鼠 Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和Cyp7b1以及STARD1^△Hep小鼠Cyp27a1和Cyp7a1的表達保持不變。此外，Stard1過表達的AD-Stard1小鼠中FXR (Nr1h4)以及Nr0b2和Abcd11表達降低（50-60%），但Nr1h4及其靶基因 Nr0b2、Abcb11和Abcb4在DEN+HFHC Stard1^△Hep小鼠與 DEN+HFHC Stard1^f/f小鼠中無差異，表明Stard1在BA合成和HCC發展中的調節作用與FXR無關。這些結果表明，HCC發展過程中肝BAs中很大一部分受STARD1調控。

BAs誘導參與自我更新、干性和炎癥基因的表達

為探討STARD1介導的BAs調控與HCC之間的關系，本研究檢測了STARD1調控BAs對參與自我更新和多能性的轉錄因子表達的影響，這些轉錄因子與HCC發病機制有關。TIC (CD133⁺/CD49f⁺)從 HCC小鼠模型分離出來，并顯示出具有致癌活性和致瘤性。用CA、TCA和βMCA聯合治療TICs，其濃度模擬AD-Stard1小鼠中觀察到的水平，結果顯示膽汁酸增加Yamanaka轉錄因子Sox2和Pouf51、干細胞標記物Nanog和Cd24、炎癥因子Ccl2和Cxcl1的表達。有趣的是，成熟肝臟中多能干細胞和早期分化基因的表達水平與胎肝和誘導多能干細胞（iPSC）衍生的肝細胞樣細胞相似。與先前研究結果一致，原代小鼠肝細胞（PMH）與CA、TCA和βMCA孵育Sox2、Myc、Klf4和Pouf51表達、干細胞相關和癌癥干細胞標記物Cd24、Cd44、Sox9和Nanog以及炎癥基因Ccl2和Cxcl2的表達顯著增加。盡管CDCA和次級BAs（DCA和LCA）對TIC具有細胞毒性，但較低濃度（10 uM）BAs可誘導參與自我更新、干細胞和炎癥的基因表達。

圖6. NASH-HCC模型中BAs的分子種類及其對自我更新、干性和炎癥相關基因表達的影響

小結

NASH驅動HCC發展是一個日益增長的公共衛生負擔，且發病率將進一步增加（與肥胖、糖尿病有關），由于對HCC發病機制認識不足，其有效治療受到限制。本研究揭示NASH驅使HCC的新機制，闡明了類固醇生成急性調節蛋白1（STARD1）在NASH驅動HCC中的關鍵作用，STARD1通過調控線粒體替代途徑中BAs的生成，刺激肝細胞多能性、自我更新以及炎癥進而促進NASH驅動HCC發生發展。本研究為肝癌的預防和治療提供了一定理論基礎和潛在靶點。

參考文獻

Laura Conde de la Rosa, et al. STARD1 promotes NASH-driven HCC by sustaining the generation of bile acids through the alternative mitochondrial pathway. Journal of Hepatology.2021.https://doi.org/10.1016/j.jhep.2021.01.028.

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