影響因子：15.7
通訊單位： 廣東醫科大學附屬湛江中心醫院
通訊作者： 管儀婷，張洪勇
伯豪技術產品：伯優®細胞核分離試劑盒
導語
顆粒細胞（Granulosa Cells, GCs）是促進卵泡持續發生過程中動態響應最強的細胞譜系。然而，其發育動態變化以及與下游轉錄調控網絡的相互作用仍不明確。本研究揭示了在小鼠和豬顆粒細胞的卵泡成熟過程中，全基因組范圍內染色質區域的重新分布情況，這種重新分布會驅動廣泛的、與發育相關的轉錄組改變。排卵階段特有的顆粒細胞激活型可及性區域（GC-activated accessibility regions, GAAs）負責增強其鄰近的顆粒細胞相關發育基因（GC-involved developmental genes, GDGs）的表達，而這些基因對于響應轉錄過程的發育信號至關重要。從作用機制來看，轉錄因子Fosl2會被強烈招募到GAAs上，從而促進染色質可及性狀態的轉變。Fosl2結合驅動GAAs信號增強，顯著上調鄰近GDG的表達。本研究揭示了卵泡成熟過程中動態變化的染色質可及性圖譜，證實了Fosl2不可或缺的作用——不僅通過重構染色質狀態來調控轉錄激活，還能調控排卵和生殖過程至關重要的復雜信號通路。
主要技術
ATAC測序、伯優®細胞核分離試劑盒
（試劑盒產品由伯豪生物提供）
研究結果
1. 顆粒細胞經歷全基因組范圍染色質景觀重塑
豬卵泡結構與卵泡發生模式和人類卵巢相似，因此本研究選用豬卵巢作為研究模型。通過體外培養豬卵丘-卵母細胞復合體，成功獲取了不同成熟階段的豬顆粒細胞和卵母細胞。卵泡從竇狀期向排卵前卵泡過渡的過程中，顆粒細胞從緊密聚集在卵母細胞周圍到逐漸分散。轉錄組分析顯示，顆粒細胞的轉錄組動態變化比卵母細胞更為顯著，竇狀期到排卵前期，顆粒細胞中Cyp11a1、Star等生物標志物及生長分化相關基因表達大幅升高，而Nr5a1等沉默基因表達降低。缺乏顆粒細胞的減數第二次分裂中期卵母細胞出現廣泛轉錄組變化，證實顆粒細胞在卵母細胞生長中起關鍵作用。ATAC-seq分析發現，顆粒細胞的染色質可及性區域主要位于含順式調控元件的基因間區，且與啟動子和增強子信號重疊，排卵前期顆粒細胞中Cyp11a1、Star等基因啟動子區域的H3K4me3信號增強，表明染色質可及性在卵泡成熟過程中調控基因表達。
圖1 卵泡成熟過程中染色質開放重塑和轉錄組變化
2. 啟動子區域的GAAs調控鄰近GDG表達
豬顆粒細胞差異可及性區域分析，鑒定出超過10,000個差異可及性區域，包括8646個顆粒細胞激活型可及性區域（GAAs）和7954個顆粒細胞失活型可及性區域（GIAs）。這些差異可及性區域主要位于轉錄起始位點附近約2kb的基因間區，與ATAC-seq峰的啟動子占據特征一致。排卵前期，GAAs側翼基因的H3K4me3和H3K27ac信號增強，而GIAs側翼基因的組蛋白修飾水平降低。表達分析證實，GAAs鄰近基因表達上調，GIAs鄰近基因表達下調，表明啟動子區域的染色質可及性與基因表達密切相關。
圖2 位于啟動子區域的GAA調控鄰近GDG的表達
3. Fosl2招募至GAAs是塑造下游轉錄組圖譜的必需條件
利用HOMER算法對GAAs中的調控元件motif進行富集分析，發現排名靠前的motif與激活蛋白1（AP-1）和鋅指蛋白（ZF）的共有結合位點高度同源，其中AP-1 motif特異性富集于GAAs。作者通過篩選卵泡成熟過程中 pGCs 的 AP-1 轉錄因子表達變化，鎖定了Fosl2，其mRNA和蛋白水平在顆粒細胞從竇狀期到排卵前期顯著升高，免疫熒光結果也證實排卵前期Fosl2的熒光強度增強。CUT&Tag分析表明，Fosl2在全基因組范圍內的結合信號隨卵泡成熟顯著增加，且差異結合峰的motif得分低于組成型結合峰，提示Fosl2表達升高可結合低親和力位點。差異染色質可及性峰與Fosl2結合峰高度相關，排卵前期特異性的Fosl2獲得性峰與新開放的染色質區域及活性調控區域相關，且富集于發育相關基因附近。約75%的GAAs與Fosl2獲得性峰重疊，Fosl2結合選擇性富集于上調基因的啟動子區域及遠端區域，表明Fosl2作為轉錄激活因子，在調控GAAs重塑中發揮核心作用。
圖3 Fosl2與GAAs的結合對于下游基因的表達至關重要
4. Fosl2在卵泡成熟過程中改變含GAAs的染色質可及性
敲低豬顆粒細胞中的Fosl2后，其染色質可及性顯著降低，且這種降低主要發生在富含Fosl2 motif位點的基因間區。Fosl2敲低后，GAAs的活性大幅下降，證實Fosl2對全局開放染色質及GAAs信號強度起到重要的調控作用。關閉的染色質區域與GAAs可及性變化呈負相關，表明Fosl2作為轉錄激活因子參與染色質可及性重構。足跡分析顯示，Fosl2敲低后，Tead4、Nrf2等多能性轉錄因子的motif結合信號降低，驗證了Fosl2對下游轉錄因子結合的影響。將Fosl2差異結合峰與卵泡成熟及Fosl2敲低后的可及性圖譜對比發現，排卵前期特異性結合峰的可及性在Fosl2沉默后顯著下降，而竇狀期特異性結合峰的可及性保持穩定。Tgfb1、Cyp11a1等排卵前期特異性GDG的Fosl2結合及GAAs活性在敲低后均減弱，而Cdc20等竇狀期特異性基因的可及性無明顯變化，證實Fosl2對維持排卵前期特異性GAAs的染色質開放狀態至關重要。
圖4 Fosl2在卵泡成熟期間調控GAA區域的染色質可及性
5. Fosl2缺陷導致染色質可及性異常并抑制GDG表達
啟動子區域Fosl2 motif數量越多的基因，Fosl2敲低后表達下調越顯著。全局分析顯示，Fosl2抑制后，包括G2M檢查點通路在內的多個發育信號通路被破壞，Cyp11a1、Star、Fshr等大量GDG顯著下調。GDG的轉錄起始位點和遠端區域均顯示出更強的Fosl2結合信號，且其染色質可及性在Fosl2敲低后大幅降低，與表達結果一致。Fshr、Mapk1等代表性GDG在排卵前期的高表達和Fosl2高結合特性，在Fosl2敲低后均明顯減弱，表明Fosl2通過結合GAAs維持染色質開放構象，進而調控GDG的廣泛轉錄程序。
隨后作者分析了小鼠顆粒細胞(mGCs)中攜帶Fosl2的GAA 模式，與豬顆粒細胞的研究結果一致，證實Fosl2調控卵泡成熟的機制在哺乳動物中保守。
圖5 Fosl2缺陷破壞染色質可及性并抑制GDG表達
6. 顆粒細胞特異性Fosl2缺失導致雌性小鼠生殖功能受損
通過構建顆粒細胞特異性Fosl2條件敲除小鼠，發現其繁殖能力顯著下降。Fosl2缺陷小鼠對促性腺激素的敏感性降低，超排卵效率下降。單細胞RNA測序分析顯示，顆粒細胞可分為6個亞群，Fosl2缺失后顆粒細胞亞群數量顯著減少，其中具有內分泌功能的壁層顆粒細胞比例下降，閉鎖顆粒細胞比例升高，卵丘顆粒細胞比例略有增加，表明Fosl2對維持顆粒細胞亞群平衡至關重要。壁層顆粒細胞和閉鎖顆粒細胞中，與年齡相關的促炎應激通路上調，發育通路下調，提示Fosl2可能參與卵巢衰老調控。7月齡Fosl2缺陷小鼠的卵巢出現嚴重結構紊亂，包括空泡化和體積縮小，黃體數量顯著減少，證實Fosl2缺失加劇卵巢衰老，且對老年小鼠卵巢功能的影響更為嚴重。
圖6 Fosl2通過維持染色質可及性調控卵泡成熟過程中顆粒細胞的譜系定向
參考文獻：
1. Zhang H, Li Z, Zhu Y, et al (2025) Fosl2 facilitates chromatin accessibility to determine developmental events during follicular maturation. Nat Commun 16:8955. https://doi.org/10.1038/s41467-025-64009-6
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