影響因子：15.7
通訊單位： 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬湛江中心醫(yī)院
通訊作者： 管儀婷，張洪勇
伯豪技術(shù)產(chǎn)品：伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒
導(dǎo)語(yǔ)
顆粒細(xì)胞（Granulosa Cells, GCs）是促進(jìn)卵泡持續(xù)發(fā)生過(guò)程中動(dòng)態(tài)響應(yīng)最強(qiáng)的細(xì)胞譜系。然而，其發(fā)育動(dòng)態(tài)變化以及與下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相互作用仍不明確。本研究揭示了在小鼠和豬顆粒細(xì)胞的卵泡成熟過(guò)程中，全基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)區(qū)域的重新分布情況，這種重新分布會(huì)驅(qū)動(dòng)廣泛的、與發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組改變。排卵階段特有的顆粒細(xì)胞激活型可及性區(qū)域（GC-activated accessibility regions, GAAs）負(fù)責(zé)增強(qiáng)其鄰近的顆粒細(xì)胞相關(guān)發(fā)育基因（GC-involved developmental genes, GDGs）的表達(dá)，而這些基因?qū)τ陧憫?yīng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的發(fā)育信號(hào)至關(guān)重要。從作用機(jī)制來(lái)看，轉(zhuǎn)錄因子Fosl2會(huì)被強(qiáng)烈招募到GAAs上，從而促進(jìn)染色質(zhì)可及性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。Fosl2結(jié)合驅(qū)動(dòng)GAAs信號(hào)增強(qiáng)，顯著上調(diào)鄰近GDG的表達(dá)。本研究揭示了卵泡成熟過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的染色質(zhì)可及性圖譜，證實(shí)了Fosl2不可或缺的作用——不僅通過(guò)重構(gòu)染色質(zhì)狀態(tài)來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活，還能調(diào)控排卵和生殖過(guò)程至關(guān)重要的復(fù)雜信號(hào)通路。
主要技術(shù)
ATAC測(cè)序、伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒
（試劑盒產(chǎn)品由伯豪生物提供）
研究結(jié)果
1. 顆粒細(xì)胞經(jīng)歷全基因組范圍染色質(zhì)景觀重塑
豬卵泡結(jié)構(gòu)與卵泡發(fā)生模式和人類(lèi)卵巢相似，因此本研究選用豬卵巢作為研究模型。通過(guò)體外培養(yǎng)豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，成功獲取了不同成熟階段的豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞。卵泡從竇狀期向排卵前卵泡過(guò)渡的過(guò)程中，顆粒細(xì)胞從緊密聚集在卵母細(xì)胞周?chē)街饾u分散。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化比卵母細(xì)胞更為顯著，竇狀期到排卵前期，顆粒細(xì)胞中Cyp11a1、Star等生物標(biāo)志物及生長(zhǎng)分化相關(guān)基因表達(dá)大幅升高，而Nr5a1等沉默基因表達(dá)降低。缺乏顆粒細(xì)胞的減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)錄組變化，證實(shí)顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。ATAC-seq分析發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的染色質(zhì)可及性區(qū)域主要位于含順式調(diào)控元件的基因間區(qū)，且與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子信號(hào)重疊，排卵前期顆粒細(xì)胞中Cyp11a1、Star等基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3信號(hào)增強(qiáng)，表明染色質(zhì)可及性在卵泡成熟過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)。
圖1 卵泡成熟過(guò)程中染色質(zhì)開(kāi)放重塑和轉(zhuǎn)錄組變化
2. 啟動(dòng)子區(qū)域的GAAs調(diào)控鄰近GDG表達(dá)
豬顆粒細(xì)胞差異可及性區(qū)域分析，鑒定出超過(guò)10,000個(gè)差異可及性區(qū)域，包括8646個(gè)顆粒細(xì)胞激活型可及性區(qū)域（GAAs）和7954個(gè)顆粒細(xì)胞失活型可及性區(qū)域（GIAs）。這些差異可及性區(qū)域主要位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近約2kb的基因間區(qū)，與ATAC-seq峰的啟動(dòng)子占據(jù)特征一致。排卵前期，GAAs側(cè)翼基因的H3K4me3和H3K27ac信號(hào)增強(qiáng)，而GIAs側(cè)翼基因的組蛋白修飾水平降低。表達(dá)分析證實(shí)，GAAs鄰近基因表達(dá)上調(diào)，GIAs鄰近基因表達(dá)下調(diào)，表明啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)密切相關(guān)。
圖2 位于啟動(dòng)子區(qū)域的GAA調(diào)控鄰近GDG的表達(dá)
3. Fosl2招募至GAAs是塑造下游轉(zhuǎn)錄組圖譜的必需條件
利用HOMER算法對(duì)GAAs中的調(diào)控元件motif進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)排名靠前的motif與激活蛋白1（AP-1）和鋅指蛋白（ZF）的共有結(jié)合位點(diǎn)高度同源，其中AP-1 motif特異性富集于GAAs。作者通過(guò)篩選卵泡成熟過(guò)程中 pGCs 的 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化，鎖定了Fosl2，其mRNA和蛋白水平在顆粒細(xì)胞從竇狀期到排卵前期顯著升高，免疫熒光結(jié)果也證實(shí)排卵前期Fosl2的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。CUT&Tag分析表明，F(xiàn)osl2在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合信號(hào)隨卵泡成熟顯著增加，且差異結(jié)合峰的motif得分低于組成型結(jié)合峰，提示Fosl2表達(dá)升高可結(jié)合低親和力位點(diǎn)。差異染色質(zhì)可及性峰與Fosl2結(jié)合峰高度相關(guān)，排卵前期特異性的Fosl2獲得性峰與新開(kāi)放的染色質(zhì)區(qū)域及活性調(diào)控區(qū)域相關(guān)，且富集于發(fā)育相關(guān)基因附近。約75%的GAAs與Fosl2獲得性峰重疊，F(xiàn)osl2結(jié)合選擇性富集于上調(diào)基因的啟動(dòng)子區(qū)域及遠(yuǎn)端區(qū)域，表明Fosl2作為轉(zhuǎn)錄激活因子，在調(diào)控GAAs重塑中發(fā)揮核心作用。
圖3 Fosl2與GAAs的結(jié)合對(duì)于下游基因的表達(dá)至關(guān)重要
4. Fosl2在卵泡成熟過(guò)程中改變含GAAs的染色質(zhì)可及性
敲低豬顆粒細(xì)胞中的Fosl2后，其染色質(zhì)可及性顯著降低，且這種降低主要發(fā)生在富含F(xiàn)osl2 motif位點(diǎn)的基因間區(qū)。Fosl2敲低后，GAAs的活性大幅下降，證實(shí)Fosl2對(duì)全局開(kāi)放染色質(zhì)及GAAs信號(hào)強(qiáng)度起到重要的調(diào)控作用。關(guān)閉的染色質(zhì)區(qū)域與GAAs可及性變化呈負(fù)相關(guān)，表明Fosl2作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與染色質(zhì)可及性重構(gòu)。足跡分析顯示，F(xiàn)osl2敲低后，Tead4、Nrf2等多能性轉(zhuǎn)錄因子的motif結(jié)合信號(hào)降低，驗(yàn)證了Fosl2對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。將Fosl2差異結(jié)合峰與卵泡成熟及Fosl2敲低后的可及性圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，排卵前期特異性結(jié)合峰的可及性在Fosl2沉默后顯著下降，而竇狀期特異性結(jié)合峰的可及性保持穩(wěn)定。Tgfb1、Cyp11a1等排卵前期特異性GDG的Fosl2結(jié)合及GAAs活性在敲低后均減弱，而Cdc20等竇狀期特異性基因的可及性無(wú)明顯變化，證實(shí)Fosl2對(duì)維持排卵前期特異性GAAs的染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)至關(guān)重要。
圖4 Fosl2在卵泡成熟期間調(diào)控GAA區(qū)域的染色質(zhì)可及性
5. Fosl2缺陷導(dǎo)致染色質(zhì)可及性異常并抑制GDG表達(dá)
啟動(dòng)子區(qū)域Fosl2 motif數(shù)量越多的基因，F(xiàn)osl2敲低后表達(dá)下調(diào)越顯著。全局分析顯示，F(xiàn)osl2抑制后，包括G2M檢查點(diǎn)通路在內(nèi)的多個(gè)發(fā)育信號(hào)通路被破壞，Cyp11a1、Star、Fshr等大量GDG顯著下調(diào)。GDG的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和遠(yuǎn)端區(qū)域均顯示出更強(qiáng)的Fosl2結(jié)合信號(hào)，且其染色質(zhì)可及性在Fosl2敲低后大幅降低，與表達(dá)結(jié)果一致。Fshr、Mapk1等代表性GDG在排卵前期的高表達(dá)和Fosl2高結(jié)合特性，在Fosl2敲低后均明顯減弱，表明Fosl2通過(guò)結(jié)合GAAs維持染色質(zhì)開(kāi)放構(gòu)象，進(jìn)而調(diào)控GDG的廣泛轉(zhuǎn)錄程序。
隨后作者分析了小鼠顆粒細(xì)胞(mGCs)中攜帶Fosl2的GAA 模式，與豬顆粒細(xì)胞的研究結(jié)果一致，證實(shí)Fosl2調(diào)控卵泡成熟的機(jī)制在哺乳動(dòng)物中保守。
圖5 Fosl2缺陷破壞染色質(zhì)可及性并抑制GDG表達(dá)
6. 顆粒細(xì)胞特異性Fosl2缺失導(dǎo)致雌性小鼠生殖功能受損
通過(guò)構(gòu)建顆粒細(xì)胞特異性Fosl2條件敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)其繁殖能力顯著下降。Fosl2缺陷小鼠對(duì)促性腺激素的敏感性降低，超排卵效率下降。單細(xì)胞RNA測(cè)序分析顯示，顆粒細(xì)胞可分為6個(gè)亞群，F(xiàn)osl2缺失后顆粒細(xì)胞亞群數(shù)量顯著減少，其中具有內(nèi)分泌功能的壁層顆粒細(xì)胞比例下降，閉鎖顆粒細(xì)胞比例升高，卵丘顆粒細(xì)胞比例略有增加，表明Fosl2對(duì)維持顆粒細(xì)胞亞群平衡至關(guān)重要。壁層顆粒細(xì)胞和閉鎖顆粒細(xì)胞中，與年齡相關(guān)的促炎應(yīng)激通路上調(diào)，發(fā)育通路下調(diào)，提示Fosl2可能參與卵巢衰老調(diào)控。7月齡Fosl2缺陷小鼠的卵巢出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)構(gòu)紊亂，包括空泡化和體積縮小，黃體數(shù)量顯著減少，證實(shí)Fosl2缺失加劇卵巢衰老，且對(duì)老年小鼠卵巢功能的影響更為嚴(yán)重。
圖6 Fosl2通過(guò)維持染色質(zhì)可及性調(diào)控卵泡成熟過(guò)程中顆粒細(xì)胞的譜系定向
參考文獻(xiàn)：
1. Zhang H, Li Z, Zhu Y, et al (2025) Fosl2 facilitates chromatin accessibility to determine developmental events during follicular maturation. Nat Commun 16:8955. https://doi.org/10.1038/s41467-025-64009-6
本產(chǎn)品專(zhuān)為從動(dòng)物組織中分離高純度的單細(xì)胞核而設(shè)計(jì)。組織通過(guò)勻漿、裂解細(xì)胞膜等步驟釋放完整細(xì)胞核，同時(shí)維持核膜穩(wěn)定性及染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，優(yōu)化的密度梯度離心或離心管柱技術(shù)可進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，從而可滿足下游單細(xì)胞組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等前沿研究領(lǐng)域?qū)?xì)胞核的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品突破傳統(tǒng)解離法對(duì)樣本活性的依賴(lài)，廣泛適用于新鮮或新鮮冰凍組織，并兼容微量組織（<10 mg）；全流程操作簡(jiǎn)捷，為復(fù)雜樣本提供標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。