血流感染（Bloodstream infection，BSI）是一種嚴(yán)重的全身性感染，可能引起一系列癥狀如高熱、寒戰(zhàn)、心動(dòng)過(guò)速、呼吸急促等，在嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致休克和多器官功能衰竭。這種疾病通常由革蘭氏陰性菌引起，包括大腸桿菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。以往針對(duì)BSI的研究多集中于嚴(yán)重感染對(duì)人體代謝的影響及可能的臨床標(biāo)志物篩選，往往忽略了微生物的代謝活動(dòng)。
2024年6月，哈佛醫(yī)學(xué)院及化學(xué)系研究團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表了題為“A metabolomics pipeline highlights microbial metabolism in bloodstream infections”的研究論文，提出了一種迭代的菌群衍生代謝物檢測(cè)方案，首次發(fā)現(xiàn)了BSI期間上調(diào)的菌群代謝產(chǎn)物：乙酰化多胺類物質(zhì)，并確定了關(guān)鍵酶及靶向藥物作用機(jī)制。
技術(shù)路線圖
分析結(jié)果
1. 篩選與BSI相關(guān)的細(xì)菌衍生代謝物
為確定BSI期間病人血漿中含量升高的菌源性代謝物，研究者設(shè)計(jì)了一組包含患者樣本、小鼠模型和體外培養(yǎng)細(xì)菌的代謝組檢測(cè)方案。首先對(duì)臨床上革蘭氏陰性菌感染患者的血漿樣本進(jìn)行靶向代謝組檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)幾種短鏈肉堿和多胺衍生物等物質(zhì)顯著增加，其中8種代謝物的水平與急性生理學(xué)和慢性健康評(píng)估II（APACHE II）呈顯著正相關(guān)；隨后提取膿毒癥盲腸漿液分別進(jìn)行小鼠造模和體外細(xì)菌培養(yǎng)，最終篩選出兩種關(guān)鍵代謝物：N-乙酰腐胺（N-acetylputrescine）和4-乙酰胺基丁酸鹽（4-acetamidobutanoate），兩者均是由多胺類物質(zhì)——腐胺乙酰化得到；最后利用腐胺分別培養(yǎng)大腸桿菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和銅綠假單胞菌（P. aeruginosa），發(fā)現(xiàn)所有菌株均產(chǎn)生N-乙酰腐胺，而只有銅綠假單胞菌能產(chǎn)生4-乙酰氨基丁酸鹽。
圖1. 靶向代謝組學(xué)確定BSI患者血漿中升高微生物衍生代謝物
此外，為了證明這套工作流程還能對(duì)未知細(xì)菌代謝物進(jìn)行優(yōu)先級(jí)排序，研究者對(duì)以上患者樣本、小鼠血漿和細(xì)菌培養(yǎng)上清液又進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)，所有結(jié)果依舊指向N-乙酰腐胺；進(jìn)一步通過(guò)關(guān)聯(lián)臨床疾病嚴(yán)重程度評(píng)分，發(fā)現(xiàn)了兩種m/z為230.1852和114.0912的未知化合物，核磁共振解譜表明這兩種物質(zhì)是2-或3-乙酰吡咯烷和N1,N8-二乙酰亞精胺，后者是一種乙酰化多胺；基于此，研究者特別關(guān)注了乙酰化多胺類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)多種造模方式的細(xì)菌活體感染均可使小鼠體內(nèi)的多種乙酰化多胺含量上升，而LPS處理的無(wú)菌炎癥造模則未出現(xiàn)此類規(guī)律。
圖2. 非靶向代謝組學(xué)鑒定新的關(guān)鍵代謝物
2.革蘭氏陰性菌中多胺乙酰化的關(guān)鍵酶：SpeG
為研究多胺乙酰化在BSI進(jìn)展中的作用，必須首先確定負(fù)責(zé)這一過(guò)程的酶，研究者迅速聚焦多胺/二胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，顧名思義這類酶能催化多胺或二胺類物質(zhì)的N-乙酰化反應(yīng)。在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中，有一個(gè)基因：SpeG，被注釋為腐胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，但之前的研究認(rèn)為它只能催化亞精胺的乙酰化，而缺乏針對(duì)腐胺的研究結(jié)論。
因此，研究者構(gòu)建了敲除SpeG基因的大腸桿菌突變體，首先確認(rèn)了SpeG的缺失使得這些細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)法產(chǎn)生N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺，而加入編碼speG的質(zhì)粒則可以回補(bǔ)；另外通過(guò)將純化酶和腐胺及乙酰輔酶A一起孵育證明了SpeG可催化腐胺乙酰化。接下來(lái)檢測(cè)SpeG對(duì)腐胺的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在生理水平下，SpeG對(duì)腐胺的催化活性極低，但當(dāng)腐胺的濃度超過(guò)生理閾值后，SpeG的活性會(huì)迅速增加，這也解釋了為何以往的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SpeG對(duì)腐胺的催化活性。最后研究了銅綠假單胞菌中是否存在SpeG的同源基因，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和BLAST搜索找到3種候選酶，隨后在SpeG敲除的大腸桿菌中分別轉(zhuǎn)染這3種基因，發(fā)現(xiàn)其中1種：PA1472，可以回補(bǔ)兩種目標(biāo)代謝物；此外AlphaFold2的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果也顯示，PA1472與SpeG晶體結(jié)構(gòu)相似；因此，即使同源性較低，但依舊可以認(rèn)為PA1472是銅綠假單胞菌中的SpeG類似物。
圖3. SpeG及其同源物催化細(xì)菌產(chǎn)生N-乙酰腐胺
3. 多胺乙酰化對(duì)細(xì)菌增殖的影響
多胺在基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，可參與維持細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)和保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。研究者首先嘗試從臨床分離出的大腸桿菌中直接敲除speG基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌死亡。隨后使用CRISPRi系統(tǒng)抑制接近70%的speG基因轉(zhuǎn)錄，觀察到大腸桿菌出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷，增殖受到抑制；細(xì)胞外N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺含量顯著降低，而細(xì)胞內(nèi)腐胺積累顯著增加，且額外補(bǔ)充N-乙酰腐胺不能挽救細(xì)菌的增殖缺陷；最后，在小鼠模型中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制speG的轉(zhuǎn)錄后，小鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。
圖4. 抑制SpeG表達(dá)影響細(xì)菌增殖
以上結(jié)果表明，speG介導(dǎo)的多胺乙酰化代謝過(guò)程在病原細(xì)菌的體內(nèi)生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。
4.抑制SpeG可減少細(xì)菌增殖，同時(shí)降低抗生素耐藥性
由于目前還沒(méi)有一款針對(duì)細(xì)菌SpeG的小分子抑制劑可以使用，因此研究者選擇了一種人類多胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶SAT1的抑制劑：Diminazene，這是一種抗癌藥物。結(jié)果表明，Diminazene針對(duì)speG的IC50與針對(duì)SAT1的類似，能夠顯著降低胞外N-乙酰腐胺和雙乙酰亞精胺含量，并且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)腐胺積累。
圖5. 抑制SpeG活性可增強(qiáng)細(xì)菌膜的透性，抑制細(xì)菌增殖
前文已知多胺可調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種細(xì)胞過(guò)程，這些過(guò)程可能對(duì)多胺代謝的擾動(dòng)非常敏感，而這也正是抗生素的靶點(diǎn)，比如DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄（喹諾酮類），翻譯（大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類）和細(xì)胞壁/膜（β-內(nèi)酰胺類和萬(wàn)古霉素）。因此研究者在大腸桿菌臨床分離株中進(jìn)行了Diminazene和臨床抗生素的藥物協(xié)同作用試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它可以降低萬(wàn)古霉素的MIC90，據(jù)此推測(cè)抑制SpeG可增加細(xì)菌外膜的透性，使得難以進(jìn)入的大型糖肽類藥物能夠順利與胞質(zhì)中的靶點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)揮作用。
圖6. 阻斷SpeG與現(xiàn)有臨床抗生素聯(lián)用，對(duì)耐藥細(xì)菌具有協(xié)同作用
研究結(jié)論
本研究提出了一種從復(fù)雜的宿主環(huán)境中分析微生物衍生代謝物的代謝組學(xué)研究流程，并應(yīng)用于研究革蘭陰性菌血流感染（BSI），發(fā)現(xiàn)BSI期間細(xì)菌代謝物：乙酰化多胺的水平升高，且篩選出負(fù)責(zé)其產(chǎn)生的酶是SpeG。在臨床應(yīng)用方面，本研究發(fā)現(xiàn)阻斷SpeG活性可減少細(xì)菌增殖，減緩發(fā)病，同時(shí)SpeG活性降低還可增強(qiáng)細(xì)菌膜通透性，增加細(xì)胞內(nèi)抗生素積累，從而減輕抗生素耐藥性增加藥物抗菌活性。
圖7. 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
Mayers JR, Varon J, Zhou RR, et al. A metabolomics pipeline highlights microbial metabolism in bloodstream infections. Cell. 2024.
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