一、介紹
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無機(jī)焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase，PPase）是一種自然界普遍存在的酶，PPase是主要以焦磷酸為底物的水解酶，參與合成糖類、核酸和蛋白質(zhì)等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸（Inorganic pyrophosphate，PPi）(P2O74-)的水解[1-2]。PPase是能將一分子的PPi水解生成兩分子的正磷acid鹽離子(如圖1所示)，這個過程是一個高放能的過程，將多種代謝過程中產(chǎn)生的PPi水解，防止其過度積累，因此該反應(yīng)可以偶聯(lián)到一些不利于生物轉(zhuǎn)化的過程中，從而促進(jìn)熱力學(xué)平衡向生物合成方向進(jìn)行[3]。PPi是一種常見的代謝副產(chǎn)物，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽聚糖、脂質(zhì)（例如膽固醇）、纖維素、淀粉和其它生物聚合物的生物合成過程中均會產(chǎn)生[2]。PPi也在蛋白質(zhì)的翻譯后修飾過程中形成，包括腺苷酸化、尿苷化和泛素化[2]。應(yīng)該注意的是，二價金屬離子是催化所必需的，最有效的是鎂離子。鎂離子可以催化酶的活性也可以與PPi形成復(fù)合物成為焦磷酸酶的反應(yīng)底物。
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圖1 PPase的分解機(jī)制[4]
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二、無機(jī)焦磷酸酶的類別
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目前，自然界中存在兩大類PPase：膜結(jié)合型焦磷酸酶(membrane-integral pyrophosphatase，M-PPase)和可溶性焦磷酸酶酶(soluble inorganic pyrophatase，s-PPase)。s-PPase又分為Ⅰ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅠ，s-PPaseⅠ)、Ⅱ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅡ，s-PPaseⅡ)和Ⅲ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase Family Ⅲ，s-PPaseⅢ)。M-PPase主要存在于植物、細(xì)菌以及寄生性生物中，可作為質(zhì)子泵和Na+泵，在生物能的保存和傳遞中發(fā)揮重要功能。s-PPase主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，廣泛分布于動物、植物以及真菌體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)焦磷酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán)比例，維持正常生命活動的作用。s-PPaseⅠ在不同生物中其寡聚物的狀態(tài)不同，s-PPaseⅡ在所有生物中都以二聚體形式存在; s-PPaseⅢ是鹵代烷脫鹵酶的變體[5]，僅存在于少數(shù)細(xì)菌中進(jìn)行鹵代烷脫鹵素酶的修飾，無明顯的生物學(xué)特征。
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目前，已經(jīng)商品化的PPase主要有三種來源，分別為：大腸桿菌、酵母和耐熱細(xì)菌。
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（一）來自大腸桿菌的PPase
大腸桿菌來源的PPase是從攜帶E. coli PPase基因的重組E. coli中獲得。該P(yáng)Pase為非耐熱型PPase，基本在25℃進(jìn)行反應(yīng)。
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圖2 大腸桿菌來源PPase的六聚體[6]
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（二）來自酵母的PPase
酵母來源的PPase是從重組E. coli菌株表達(dá)純化的攜帶有從釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）克隆的PPase基因，該P(yáng)Pase為非耐熱型PPase，基本在25℃進(jìn)行反應(yīng)。由于酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白比大腸桿菌表達(dá)的更復(fù)雜，其功能也可能較為全面。
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圖3 酵母來源PPase的結(jié)構(gòu)[7]
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（三）來自耐熱細(xì)菌的PPase
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耐熱性PPase來源于古細(xì)菌中生存在高溫環(huán)境的嗜熱菌。嗜熱菌的酶對溫度要求不敏感且可通過提高溫度來加快動力學(xué)反應(yīng)。從P.horikoshii中分離的PPase，其最適溫度為88℃。在100℃和8M尿素的情況下均具有一定活性。市面上的耐熱型PPase多是Thermophile Iitorails來源。
三、PPase的適用實驗
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PPase在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，可以防止無機(jī)焦磷酸影響生物體的正常代謝，近年來隨著生物催化劑的興起，其體外功能也逐漸顯現(xiàn)出來。PPase不僅能夠在DNA測序反應(yīng)、PCR和單堿基延伸反應(yīng)中防止PPi的積累造成的反應(yīng)抑制，其還用于體外轉(zhuǎn)錄過程，用以增加RNA的產(chǎn)量以及通過酶促合成增加GDP修飾糖的產(chǎn)量。此外，PPase還常用于量化釋放PPi作為副產(chǎn)物的反應(yīng)速率，例如單核苷酸多態(tài)性基因分型反應(yīng)、病毒RNA依賴性RNA聚合酶的RNA合成和氨酰-tRNA合成酶活性[8]。
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（一）DNA擴(kuò)增
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DNA合成中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是以DNA為模板，在DNA聚合酶作用下加入四種核苷酸和引物在體外大量擴(kuò)增DNA的技術(shù)手段，其中包括高溫變性DNA解旋氫鍵斷裂成單鏈，溫度降低退火引物結(jié)合模板DNA，后溫度升高在聚合酶的作用下以四種核苷酸為底物，從引物開始5’到3’端延伸，通過循環(huán)達(dá)到擴(kuò)增的目的。在dNTP的結(jié)合中會有PPi產(chǎn)生，通過焦磷酸酶的作用將其水解，促進(jìn)DNA的合成，由于該過程是高溫反應(yīng)，需要選用耐高溫的PPase，使得能夠正常水解PPi。
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等溫擴(kuò)增技術(shù)是通過在不同活性的酶和特殊引物條件下，在恒定溫度下快速擴(kuò)增核酸的技術(shù)，其中應(yīng)用較為廣泛的包括LAMP環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（recombinaseaided amplification，RAA）以及依賴解旋酶等溫擴(kuò)增技術(shù)(helicase-dependent amplification，HDA)。等溫擴(kuò)增技術(shù)的實驗過程需要核苷酸參與，合成時產(chǎn)生的焦磷酸也可以在PPase的作用下水解，由于其中有些等溫擴(kuò)增技術(shù)采用的是高溫反應(yīng)，所以此過程也需要選用耐熱型的PPase。
（二）RNA體外轉(zhuǎn)錄
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RNA體外轉(zhuǎn)錄（In vitro transcription，IVT）是在聚合酶的作用下，以質(zhì)粒DNA為模板，在4種NTP的參與下，體外合成RNA的一種技術(shù)。該過程也會有PPi的產(chǎn)生，在反應(yīng)體系中加入PPase可以促進(jìn)正向反應(yīng)，避免過多的焦磷酸抑制反應(yīng)，增加RNA的產(chǎn)量(如圖4所示)。由于常規(guī)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度相對較低，所以可以選用酵母來源或者大腸來源的PPase。
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近岸蛋白提供三種來源的PPase，包括酵母來源、大腸桿菌來源及耐熱型PPase，均能水解PPi、增強(qiáng)DNA復(fù)制能力、提高RNA產(chǎn)量；除此之外，還提供酵母來源的GMP級別PPase。GMP級酵母來源PPase是利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)獲得，藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程(如表1所示)，保障其生產(chǎn)過程及所涉及原輔料可追溯。
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表1 GMP級酵母來源PPase質(zhì)量要求
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體外轉(zhuǎn)錄實驗驗證
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圖4：體外轉(zhuǎn)錄實驗中，加入無機(jī)焦磷酸酶對RNA的產(chǎn)量有明顯提升。泳道1為轉(zhuǎn)錄體系內(nèi)添加了無機(jī)焦磷酸酶，泳道2未添加。
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表2 相關(guān)產(chǎn)品清單
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目錄號 |
產(chǎn)品名稱 |
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Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade |
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Pyrophosphatase, Inorganic（yeast） |
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Pyrophosphatase, Inorganic （E.coli） |
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Thermostable Inorganic Pyrophosphatase |
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Vaccinia Capping System |
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mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase |
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DNase I |
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E. coli Poly(A) Polymerase |
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RNase R |
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RE057 |
BspQI |
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mRNA Enzymes DIBA Kit |
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參考資料
[1]Ferjani A, Segami S, Horiguchi G, et al. Keep an eye on PPi: the vacuolar-type H+-pyrophosphatase regulates postgermina-tive development in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2011, 23(8): 2895-2908.
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[2] Saha S, Mina B L, Gopinath K A, et al. Relative changes in phosphatase activities as influenced by source and application rate of organic composts in field crops[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6): 1750-1757.
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[6]Valeriya R. Samygina, Inorganic pyrophosphatases: structural diversity serving the function.[J].Russ. Chem. Rev., 2016, 85 (5) 464 ± 476.
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[7]Daouda, M. , Bouchra, E. , Roman, P. , Aurelio, S. and Abdelaziz, S. (2017) Inorganic Pyrophosphatases: Study of Interest.Advances in Bioscience and Biotechnology,8, 388-397.
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[8]McMillan Lana J,Hepowit Nathaniel L,Maupin-Furlow Julie A,Archaeal Inorganic Pyrophosphatase Displays Robust Activity under High-Salt Conditions and in Organic Solvents.[J] .Appl Environ Microbiol, 2016, 82: 538-48.
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蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應(yīng)用解決方案的高新技術(shù)企業(yè)，主營業(yè)務(wù)為靶點(diǎn)及細(xì)胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售，并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)。公司定位為醫(yī)療健康與生命科學(xué)領(lǐng)域原料與技術(shù)解決方案的上游供應(yīng)商，致力于為下游客戶提供及時、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及服務(wù)，助力全球生物醫(yī)藥企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)的技術(shù)與產(chǎn)品創(chuàng)新升級。
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