一、介紹
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無機焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase，PPase）是一種自然界普遍存在的酶，PPase是主要以焦磷酸為底物的水解酶，參與合成糖類、核酸和蛋白質等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸（Inorganic pyrophosphate，PPi）(P2O74-)的水解[1-2]。PPase是能將一分子的PPi水解生成兩分子的正磷acid鹽離子(如圖1所示)，這個過程是一個高放能的過程，將多種代謝過程中產生的PPi水解，防止其過度積累，因此該反應可以偶聯到一些不利于生物轉化的過程中，從而促進熱力學平衡向生物合成方向進行[3]。PPi是一種常見的代謝副產物，包括DNA、RNA、蛋白質、肽聚糖、脂質（例如膽固醇）、纖維素、淀粉和其它生物聚合物的生物合成過程中均會產生[2]。PPi也在蛋白質的翻譯后修飾過程中形成，包括腺苷酸化、尿苷化和泛素化[2]。應該注意的是，二價金屬離子是催化所必需的，最有效的是鎂離子。鎂離子可以催化酶的活性也可以與PPi形成復合物成為焦磷酸酶的反應底物。
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圖1 PPase的分解機制[4]
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二、無機焦磷酸酶的類別
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目前，自然界中存在兩大類PPase：膜結合型焦磷酸酶(membrane-integral pyrophosphatase，M-PPase)和可溶性焦磷酸酶酶(soluble inorganic pyrophatase，s-PPase)。s-PPase又分為Ⅰ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅠ，s-PPaseⅠ)、Ⅱ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅡ，s-PPaseⅡ)和Ⅲ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase Family Ⅲ，s-PPaseⅢ)。M-PPase主要存在于植物、細菌以及寄生性生物中，可作為質子泵和Na+泵，在生物能的保存和傳遞中發揮重要功能。s-PPase主要存在于胞質內，廣泛分布于動物、植物以及真菌體內，具有調節焦磷酸基團和磷酸基團比例，維持正常生命活動的作用。s-PPaseⅠ在不同生物中其寡聚物的狀態不同，s-PPaseⅡ在所有生物中都以二聚體形式存在; s-PPaseⅢ是鹵代烷脫鹵酶的變體[5]，僅存在于少數細菌中進行鹵代烷脫鹵素酶的修飾，無明顯的生物學特征。
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目前，已經商品化的PPase主要有三種來源，分別為：大腸桿菌、酵母和耐熱細菌。
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（一）來自大腸桿菌的PPase
大腸桿菌來源的PPase是從攜帶E. coli PPase基因的重組E. coli中獲得。該PPase為非耐熱型PPase，基本在25℃進行反應。
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圖2 大腸桿菌來源PPase的六聚體[6]
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（二）來自酵母的PPase
酵母來源的PPase是從重組E. coli菌株表達純化的攜帶有從釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）克隆的PPase基因，該PPase為非耐熱型PPase，基本在25℃進行反應。由于酵母系統表達的蛋白比大腸桿菌表達的更復雜，其功能也可能較為全面。
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圖3 酵母來源PPase的結構[7]
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（三）來自耐熱細菌的PPase
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耐熱性PPase來源于古細菌中生存在高溫環境的嗜熱菌。嗜熱菌的酶對溫度要求不敏感且可通過提高溫度來加快動力學反應。從P.horikoshii中分離的PPase，其最適溫度為88℃。在100℃和8M尿素的情況下均具有一定活性。市面上的耐熱型PPase多是Thermophile Iitorails來源。
三、PPase的適用實驗
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PPase在生物體內發揮著重要作用，可以防止無機焦磷酸影響生物體的正常代謝，近年來隨著生物催化劑的興起，其體外功能也逐漸顯現出來。PPase不僅能夠在DNA測序反應、PCR和單堿基延伸反應中防止PPi的積累造成的反應抑制，其還用于體外轉錄過程，用以增加RNA的產量以及通過酶促合成增加GDP修飾糖的產量。此外，PPase還常用于量化釋放PPi作為副產物的反應速率，例如單核苷酸多態性基因分型反應、病毒RNA依賴性RNA聚合酶的RNA合成和氨酰-tRNA合成酶活性[8]。
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（一）DNA擴增
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DNA合成中的聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是以DNA為模板，在DNA聚合酶作用下加入四種核苷酸和引物在體外大量擴增DNA的技術手段，其中包括高溫變性DNA解旋氫鍵斷裂成單鏈，溫度降低退火引物結合模板DNA，后溫度升高在聚合酶的作用下以四種核苷酸為底物，從引物開始5’到3’端延伸，通過循環達到擴增的目的。在dNTP的結合中會有PPi產生，通過焦磷酸酶的作用將其水解，促進DNA的合成，由于該過程是高溫反應，需要選用耐高溫的PPase，使得能夠正常水解PPi。
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等溫擴增技術是通過在不同活性的酶和特殊引物條件下，在恒定溫度下快速擴增核酸的技術，其中應用較為廣泛的包括LAMP環介導的等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶介導等溫擴增技術（recombinaseaided amplification，RAA）以及依賴解旋酶等溫擴增技術(helicase-dependent amplification，HDA)。等溫擴增技術的實驗過程需要核苷酸參與，合成時產生的焦磷酸也可以在PPase的作用下水解，由于其中有些等溫擴增技術采用的是高溫反應，所以此過程也需要選用耐熱型的PPase。
（二）RNA體外轉錄
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RNA體外轉錄（In vitro transcription，IVT）是在聚合酶的作用下，以質粒DNA為模板，在4種NTP的參與下，體外合成RNA的一種技術。該過程也會有PPi的產生，在反應體系中加入PPase可以促進正向反應，避免過多的焦磷酸抑制反應，增加RNA的產量(如圖4所示)。由于常規體外轉錄反應溫度相對較低，所以可以選用酵母來源或者大腸來源的PPase。
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近岸蛋白提供三種來源的PPase，包括酵母來源、大腸桿菌來源及耐熱型PPase，均能水解PPi、增強DNA復制能力、提高RNA產量；除此之外，還提供酵母來源的GMP級別PPase。GMP級酵母來源PPase是利用大腸桿菌大規模發酵表達獲得，藥用規格原輔料生產，并嚴格控制宿主蛋白質殘留、核酸殘留等，符合GMP規范的產品生產與質量管理規程(如表1所示)，保障其生產過程及所涉及原輔料可追溯。
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表1 GMP級酵母來源PPase質量要求
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體外轉錄實驗驗證
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圖4：體外轉錄實驗中，加入無機焦磷酸酶對RNA的產量有明顯提升。泳道1為轉錄體系內添加了無機焦磷酸酶，泳道2未添加。
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表2 相關產品清單
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目錄號 |
產品名稱 |
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Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade |
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Pyrophosphatase, Inorganic（yeast） |
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Pyrophosphatase, Inorganic （E.coli） |
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Thermostable Inorganic Pyrophosphatase |
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Vaccinia Capping System |
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mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase |
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DNase I |
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E. coli Poly(A) Polymerase |
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RNase R |
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RE057 |
BspQI |
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mRNA Enzymes DIBA Kit |
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參考資料
[1]Ferjani A, Segami S, Horiguchi G, et al. Keep an eye on PPi: the vacuolar-type H+-pyrophosphatase regulates postgermina-tive development in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2011, 23(8): 2895-2908.
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[2] Saha S, Mina B L, Gopinath K A, et al. Relative changes in phosphatase activities as influenced by source and application rate of organic composts in field crops[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6): 1750-1757.
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[3]Terkeltaub RA,Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.[J] .Am J Physiol Cell Physiol, 2001, 281: C1-C11.
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[4]王磊. 嗜熱無機焦磷酸酶的重組表達及催化特性分析[D].西北農林科技大學,2014.
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[5]賢加歡,張美萍,孫春玉,王艷芳,王康宇,陳靜,趙明珠,王義.可溶性焦磷酸酶的研究進展[J].基因組學與應用生物學,2019,38(09):4030-4035.DOI:10.13417/j.gab.038.004030.
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[6]Valeriya R. Samygina, Inorganic pyrophosphatases: structural diversity serving the function.[J].Russ. Chem. Rev., 2016, 85 (5) 464 ± 476.
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[7]Daouda, M. , Bouchra, E. , Roman, P. , Aurelio, S. and Abdelaziz, S. (2017) Inorganic Pyrophosphatases: Study of Interest.Advances in Bioscience and Biotechnology,8, 388-397.
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[8]McMillan Lana J,Hepowit Nathaniel L,Maupin-Furlow Julie A,Archaeal Inorganic Pyrophosphatase Displays Robust Activity under High-Salt Conditions and in Organic Solvents.[J] .Appl Environ Microbiol, 2016, 82: 538-48.
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