期刊：gut
影響因子：24.5
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導語
慢性胰腺炎（CP）是一種可能致命的外分泌胰腺疾病，目前尚無特效或有效的治療方法。由于難以獲得胰腺組織，人們對人類CP的局部免疫反應或發病機制知之甚少。我們試圖使用來自CP和非CP器官供體不同病因患者的組織來表征胰腺免疫反應，以鑒定與人類CP相關的關鍵信號分子。
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研究技術
我們通過對來自器官供體、遺傳性全胰腺切除術和特發性CP患者的胰腺免疫細胞進行測序和t細胞受體（TCR）測序，對轉錄組和表位進行單細胞水平的細胞索引。我們通過對第二例CP隊列患者進行流式細胞術和功能分析來驗證基因表達數據。
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研究路線
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研究結果
1. 人胰腺免疫細胞轉錄圖譜揭示了CP中獨特的疾病特異性特征
從捐贈者（n=3）和CP患者（遺傳n=5和特發性n=4）收集胰腺組織，分選免疫細胞，用13種不同的表面蛋白抗體進一步染色，后進行scRNA-seq和scTCR-seq。質控后獲得28547個細胞，分17個cluster。鑒定出的主要免疫細胞是T細胞、髓系細胞、B細胞和肥大細胞。
進一步分析發現，對照胰腺組織的主要免疫細胞是髓系細胞，而CP組織的胰腺免疫細胞主要是T細胞。巨噬細胞，包括cluster5、9和11，在對照組中富集；t細胞簇在CP組中擴大，cluster2是遺傳性CP中富集的主要t細胞簇，而cluster0在特發性CP中占優勢。對CP與對照組之間的DEGs進行了GSEA分析，結果有炎癥反應的強烈特征，包括細胞凋亡、缺氧、白細胞介素2-STAT5、干擾素和腫瘤壞死因子（TNF）-α信號通路?？偟膩碚f，來自對照組和CP組織的胰腺免疫細胞分析表明，局部致病組織區域存在疾病特異性免疫反應，遺傳性和特發異性CP組之間有不同的免疫轉錄組和蛋白表達特征。
2. 遺傳性和特發性CP之間的胰腺T細胞的不同轉錄組特征
在對照組和CP患者胰腺中存在的主要免疫細胞群是T細胞。分析了T細胞亞群（cluster0、1和2)，共15 913個細胞，鑒定了13種不同的T細胞。UMAP顯示細胞簇明顯分為三組：對照組、遺傳性CP和特發性CP。對照細胞主要由GZMA+細胞毒性CD8+ T細胞組成，遺傳性CP細胞主要由CD4+ Th亞群組成，包括CCR6+、TNF+（Th1）、調節性T（Treg）細胞和HLA-DA+ CD8+ T細胞。然而，FTH1+ CD4+和BAG3+ CD8+ T細胞是特發性CP樣本中主要的T細胞。分析了遺傳性CP與特發性CP相比，在總T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞中的DEGs。與特發性CP相比，其中一些基因在遺傳性基因中表達上調，它們包括趨化受體和配體，如CCR6、CXCR4、GPR183和CCL20，表明它們參與了遺傳性CP中CD4+T細胞的募集。
3. 在CP中，CD8+T細胞依賴的獨特的TCR庫變化
從對照和CP的12個樣本中，共鑒定了5180個T細胞，12 856對特異的αβ TCR序列。在對照組T細胞中，15.6%±6.0%獨特的克隆型由兩個或兩個以上的細胞共享，顯著高于遺傳性CP T細胞（4.03%±1.6%）。與此結果相對應，對照組T細胞的Gini coefficient（克隆性指數）也顯著高于遺傳性CP組，表明在遺傳性CP的T細胞中，克隆擴增率較低。不同T細胞簇的Gini coefficient顯示在對照和 CP組CD8+ T細胞傾斜克隆擴增。當把T細胞分為CD8+ T細胞和其他T細胞時，CD8+ T細胞的基尼系數明顯高于其余T細胞。通過比較CD8A基因表達的UMAPs和克隆擴增的細胞群，進一步證實了這一結果。
4. 在CP中，t細胞譜系和共享的抗原結合基序之間的獨特的相互作用
為了解T細胞簇之間的聯系和起源，通過分析所有組或每個組內的克隆型，檢查了獨特的克隆型（匹配的單細胞TCR-αβ譜）和它們在不同cluater之間的重疊。在 CD8+ cytotoxic T-cell clusters (Tc-1 and Tc-3)之間發現了最大的克隆型重疊，它們有40個共享的克隆型，主要由特發性CP組驅動。有63 個獨特的克隆型在特發性CP的CD8+ cytotoxic T-cell clusters中發現了共享的克隆型。CCR6+ CD4+ T細胞與Th1細胞之間的克隆型重疊最高，有23個共享克隆型，這些重疊主要發生在遺傳性CP中。這些共享的TCR克隆型闡明了不同t細胞亞型之間的獨特相互作用和每個CP組的克隆動力學。
為了檢驗在對照組和CP樣本中發現的胰腺TCR是否識別相同的抗原，通過GLIPH2分析篩選TCR CDR3β氨基酸序列上共享的抗原結合基序來識別相同表位的集群TCR。根據最終的評分，從所有三組（對照組和兩個CP組）中選擇了至少兩個個體共享的基序，其中顯示了三個聚類，因為它們在配對的CDR3α序列中也具有一定程度的相似性。結果顯示，所選的集群主要由遺傳性和特發性CP組的個體共享，而不是對照組。值得注意的是，三個具有獨特共同基序的候選簇中的大多數tcr主要由遺傳性CP組的個體共享，這表明遺傳性CP中的T細胞更有可能對共同抗原或表位發生反應。
5. 人胰腺髓系細胞的明顯轉錄改變
髓系細胞是在對照組和CP受試者的胰腺中發現的胰腺免疫亞群的另一個關鍵組成部分。進一步對髓系的亞群（clusters 3, 4, 5, 6, 9 and 11）進行細分，鑒定出11個不同細胞亞群，包括單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)。并且每組細胞（對照組、遺傳性CP或特發性CP）聚集在一起，重疊最小。與CP患者比較，CD68+和CD163+巨噬細胞和S100A8+單核細胞（clusters3和8）的頻率顯著升高。遺傳性CP中CCL20+單核細胞的頻率明顯高于對照組或特發性CP樣本。CP患者與對照組的DEG分析顯示了各種炎癥和趨化分子，如IL1B、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CCL4，這些分子在富集的CP髓系細胞中顯著上調和炎癥信號通路。遺傳性CP與特發性CP的DEG分析發現包括HLA-DR、CCL20和IL1B顯著上調。
6. 在遺傳性CP，CCR6-CCL20軸功能分析
與遺傳性CP的CD4+ T細胞和單核細胞群體中CCR6-CCL20軸的基因的轉錄表達一致，通過分析總免疫細胞群的差異，比較遺傳性CP和特發性CP，證實了這種獨特的趨化因子和受體軸的參與。遺傳性CP和特發性CP相比，CCR6和CCL20是顯著上調的前20個基因之一。此外，為了評估髓系細胞和T細胞之間的串擾，通過受體配體的表達水平分析了髓系細胞和T細胞區室之間的細胞因子或趨化因子受體-配體的相互作用。CCR6-CCL20軸僅在兩組CP中表達，遺傳性CP中CCR6-CCL20的表達明顯高于特發性CP。最后，通過流式細胞術檢測了從第二組對照組和CP患者中分離出來的T細胞中CCR6蛋白的表達。與對照組相比，遺傳性CP中CD8+ T細胞的頻率顯著降低，而CD4+ T細胞的頻率顯著升高。與scRNA-seq結果一致，特發性CP中CD8+或CD4+ T細胞的頻率介于中間，介于對照組和遺傳性CP之間。與對照組或特發性CP相比，遺傳性CP中表達CCR6的CD4+ T細胞的百分比顯著增加。遺傳性CP樣本的CD4+ T細胞中CCR6蛋白表達升高后，通過ELISA檢測了遺傳性CP中胰腺單核細胞分泌的CCL20。此外，通過免疫熒光驗證，在遺傳性CP的胰腺組織切片CCR6+和CCL20+細胞分別與CD4+和CD45+免疫細胞共定位。接下來，通過ccl20介導的細胞遷移實驗來評估T細胞中CCR6表達的功能意義。
進行Transwell趨化，CXCL12作為陽性對照，來自遺傳性CP組織的胰腺免疫細胞向可溶性重組人CCL20遷移，其濃度與以前的報道相當。胰腺浸潤性T細胞對CCL20的趨化反應性的增加證實了遺傳性CP中受體（CCR6）表達的增加的功能意義。這些數據表明，T細胞通過CCR6-CCL20軸遷移并浸潤遺傳性CP中的病變胰腺。
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參考文獻：
Lee Bomi,Namkoong Hong,Yang Yan et al. Single-cell sequencing unveils distinct immune microenvironments with CCR6-CCL20 crosstalk in human chronic pancreatitis.[J] .Gut, 2022, 71: 1831-1842.