低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）的升高是導致高血脂的“元兇”之一， 它的含量可以反映血漿中運輸內源性膽固醇的主要載體——低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein, LDL)的水平。肝細胞表面的低密度脂蛋白受體（LDLR）可以與LDL結合形成 LDL-R-LDL 復合物從而降解LDL-C，之后 LDLR 再循環回到細胞表面。
PCSK9是LDL-C找的一個“幫手”
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）是一種參與LDLR生命周期的分泌性蛋白，通過促進LDLR降解來調節血漿LDL-C 水平。PCSK9 是LDLR的主要下調因子：PCSK9 與 LDLR 的胞外結構域結合產生了一種復合物，該復合物易位至內體，其中酸性 pH 增強了 PCSK9 與 LDLR 的結合親和力，使LDLR在溶酶體中的降解增強，防止 LDLR 再循環到細胞膜，進而引起循環LDL-C水平增高。
Figure.1：ScienceDirect
靶向PCSK9的研發策略
目前，越來越多的企業看好PCSK9靶向藥市場，并開發出多款在研藥物。以單抗為主，此外還包括小分子藥物、siRNA反義寡核苷酸療法、環肽類藥物藥物和抑制循環 PCSK9 活性的 PCSK9 疫苗等，基因編輯技術直接修改 PCSK9 基因以實現一勞永逸的預防心血管疾病也在進一步研究當中。
Figure.2 A: Strategiestargeting PCSK9. PCSK9 activity can be inhibited at several levels. B: PCSK9 function and potential targets forinhibition.
單克隆抗體
2015年7月、8月，FDA分別批準了賽諾菲／再生元聯合開發的Alirocumab（阿利西尤單抗）以及安進開發的Evolocumab（依洛尤單抗）兩款單抗類產品，可阻斷循環PCSK9蛋白和LDLR之間的相互作用。
小分子抑制劑盡管破壞 PCSK9-LDLR 結合的治療性抗體/抑制劑可降低 LDL-C 濃度和心血管疾病風險是目前基于PCSK9靶點的主流開發策略。但是，LDLR 的表皮生長因子前體同源結構域 A (EGF-A) 通過平面界面與 PCSK9主要接觸對識別小分子 PCSK9-LDLR 干擾物的篩選提出了挑戰。
諾華公司創新開發基于親和力篩選方案，基于Peptide Discovery Platform System (PDPS) 技術平臺，研究人員使用生物素化PCSK9 蛋白偶聯磁珠，對大環肽分子進行篩選：從包含 > 1013 個獨特肽的初始庫中，鏈霉親和素磁珠富集了 PCSK9 特異性結合劑，最終通過多次復篩并配合二代測序技術發現小分子抑制劑13PCSK9i；進一小鼠動物模型驗證發現隨13PCSK9i劑量增加，降低血漿膽固醇水平并增加肝臟 LDLR 密度。13PCSK9i 通過獨特的變構機制發揮作用，是迄今為止鑒定的具有體內 PCSK9-LDLR 阻斷功能的最小分子，其分子量約為常規抗體的1/100此外，通過對初始文庫篩選，發現特異性PCSK9識別高親和力配體。這些配體利用獨特的誘導貼合口袋并部分破壞 PCSK9-LDLR 相互作用?；诖私Y構的設計的分子具有增強的功能和藥代動力學特性。這一系列研究成果為動脈粥樣硬化新類型小分子抑制劑開發提供新的開發方向 [2]。
Figure. 3
小干擾RNA（siRNA）
Inclisiran是一種由阿斯利康開發的靶向PCSK9的雙鏈小干擾RNA（siRNA），其可以通過特異性地降解PCSK9 mRNA來抑制翻譯，減少PCSK9蛋白的合成，從而降低血漿LDL-C水平。研究顯示，Inclisiran可使血漿中LDL-C水平降低50%，且擁有半年一次給藥潛力，是當之無愧的明星藥。該藥目前已獲得歐洲藥品管理局和美國FDA的批準。反義寡核苷酸療法（ASO）
AZD8233是阿斯利康和Ionis合作而獲得的一款PCSK9靶向反義寡核苷酸（ASO）藥物，用于靶向抑制肝細胞內PCSK9 mRNA的翻譯和蛋白合成。I期臨床試驗結果顯示，單劑AZD8233皮下注射可實現PCSK9水平降低超 90％，LDL-C 水平降低 70％。2021年12 月 16 日， AZD8233 首次在國內遞交臨床申請。環肽類藥物
MK-0616是一種可通過消化道吸收的合成的小分子環狀肽類，能阻斷PCSK9蛋白和LDLR的結合。臨床試驗結果顯示：MK-0616在高膽固醇患者中的耐受性良好，劑量達300毫克，沒有死亡或嚴重副作用。在一項多劑量研究中，在當前他汀類藥物治療的基礎上服用MK-0616的患者，LDL-C比基線水平降低了約65%。基因編輯技術
CRISPR單堿基編輯技術是一種正處在動物實驗階段的降脂療法。研究顯示，在非人類靈長類動物中，單次輸注被PCSK9信使RNA包圍的脂質納米顆粒，可有效降低PCSK9蛋白和LDL-C水平，且只有低水平的脫靶編輯。更多替代治療（如鋅指核酸酶、CRISPR-Cas9核酸酶）的研究正在進行中，還需要進一步評估脫靶編輯水平和長期安全性。總結：
PCSK9越來越受到各藥企的青睞，隨著研究的深入，除了降血脂，PCSK9靶向藥還有望用于治療糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病，以及與代謝密切相關的疾病如阿爾茲海默病、腫瘤等。
ACROBiosystems開發了一系列PCSK9相關蛋白用于動脈粥樣硬化等相關研究。產品特征
產品覆蓋多種屬、多標簽，覆蓋D374Y、R194A等突變位點
高純度：經SDS-PAGE驗證純度＞95%；經SEC-MALS驗證純度＞90%
高生物活性：經ELISA/SPR/BLI/FACS驗證，免費提供 Protocol
生物素化的產品可以滿足抗體/小分子抑制劑創新篩選應用方案需求
多樣化產品選擇—PCSK9抑制劑篩選試劑盒除了重組蛋白相關以外，ACROBiosystems 基于其獨特的生物素標記蛋白產品，開發了PCSK9抑制劑篩選試劑盒（PCSK9 [Biotinylated] : LDL R Inhibitor Screening ELISA Assay Pair），用于對Human PCSK9 與human LDL R 結合的抑制劑進行快速高通量篩選。產品列表
>>>均一結構及純度經MALS驗證
The purity of Human PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-H5223) is more than 90% and the molecular weight of this protein is around 70-80 kDa verified by SEC-MALS.
>>>高生物活性經ELISA驗證
Immobilized Human PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-H5223) at 2 μg/mL (100 μL/well) on an Nickel Coated plate can bind Human PCSK9 Mab (RN316), Human IgG1 with a linear range of 0.2-3 ng/mL (Routinely tested).
Immobilized Human LDL R, His Tag (Cat. No. LDR-H5224) at 10 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human PCSK9, Avitag,His Tag (Cat. No. PC9-H82E7) with a linear range of 8-63 ng/mL (QC tested).
>>>高生物活性經BLI驗證
Loaded Human LDL R, Fc Tag (Cat. No. LDR-H5254) on Protein A Biosensor, can bind Cynomolgus PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-C5223) with an affinity constant of 1.46 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).
>>>高生物活性經FACS驗證
FACS analysis shows that the effect of Human PCSK9 (D374Y), His Tag (Cat. No. PCY-H5225) inhibiting LDL uptake in HepG2 cells was neutralized by Anti-Human PCSK9 antibody. The concentration of PCSK9 used is 5 μg/mL. The EC50 for Anti-Human.
PCSK9 [BIOTINYLATED]: LDL R BINDING IN THE ABSENCE OF INHIBITORS
Immobilized human LDL R protein at 3 μg/mL (100 μL/well) can bind biotinylated human PCSK9 with a linear range of 0.000625-0.02 μg/mL when detected by Streptavidin-HRP. Background was subtracted from data points before curve fitting (QC tested).
INHIBITION OF PCSK9 [BIOTINYLATED]: LDL R BINDING BY ANTI-PCSK9 NEUTRALIZING ANTIBODY
Serial dilutions of anti-PCSK9 neutralizing antibody (Catalog # PC9-NA003) (1:2 serial dilutions, from 20 μg/mL to 0.04 μg/mL or 133.33 nM to 0.26 nM) were added into Biotinylated PCSK9: LDL R binding reactions. Background was subtracted from data points prior to log transformation and curve fitting (QC tested).
PC9-H82E7: Biotinylated Human PCSK9 Protein, Avitag?,His Tag (MALS verified)，我們主要使用此抗原來進行ELISA實驗，在方法開發階段使用FC標簽的pcsk9包被無果后，購買了此款生物素標記的pcsk9抗原，在提前包被SA后，再進行此抗原包被，成功完成本實驗，解決了我們實驗過程中包被抗原的難題。
這個應用場景的設計是不是讓各位老師眼前一亮呢？
原來還可以借助生物素-鏈霉親和素系統的強結合能力來解決問題！不過，自己鋪板的時候也要注意手法哦，否則也會有鋪板不均勻的情況存在。
作為您實驗路上值得信賴的伙伴，ACROBiosystems也推薦您使用我們的鏈霉親和素預包被96孔板（Cat.No. SP-11），利用生物素-鏈霉親和素系統的高特異性和高靈敏度特性，可將生物素化蛋白固定在鏈霉親和素包被96孔板上以應用于各類實驗，避免自己包被鋪板不均一的問題，且與非生物素體系相比檢測速度更快、結合能力更強、非特異背景更低。
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inquiry@acrobiosystems.com
15117918562
（備注：姓名+公司）
參考文獻：
1. Seidah NG, Prat A, Pirillo A, Catapano AL, Norata GD. Novel strategies to target proprotein convertase subtilisin kexin 9: beyond monoclonal antibodies. Cardiovasc Res. 2019;115(3):510-8.
2. Ben-Naim L, Khalaila I, Papo N. Modifying pH-sensitive PCSK9/LDLR interactions as a strategy to enhance hepatic cell uptake of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Protein Eng Des Sel. 2022;35.
3. Brousseau ME, Clairmont KB, Spraggon G, Flyer AN, Golosov AA, Grosche P, et al. Identification of a PCSK9-LDLR disruptor peptide with in vivo function. Cell Chem Biol. 2022;29(2):249-58 e5.