通過免疫檢查點抑制劑(ICI)治療重新激活抗腫瘤免疫是當前腫瘤治療的關鍵，在一些腫瘤患者中療效顯著。雖然阻斷抑制性T細胞受體，如程序性細胞死亡-1 (PD-1)或其配體PD-L1，能激活抗腫瘤T細胞反應并顯示出強大的臨床療效，但只有40%的黑色素瘤患者對治療有反應。研究表明，共生菌可以影響宿主的抗腫瘤免疫；最近的幾項研究也發現益生菌補充劑和黑色素瘤患者免疫治療反應之間的聯系。然而對于益生菌對腫瘤患者ICI反應性的影響，以及驅動這些影響的機制尚不清楚。來自美國匹茲堡大學Marlies Meisel團隊揭示了在腫瘤微環境中，益生菌釋放的芳基烴受體(AhR)激動劑吲哚-3-甲醛(I3A)和CD8+T細胞之間的菌群-宿主相互作用，可有效增強抗腫瘤免疫并促進ICI效果，相關研究成果發表于Cell。
Lr誘導抗腫瘤免疫并促進臨床前黑色素瘤的ICI
選擇長雙歧桿菌（Bl）、羅伊氏乳桿菌（Lr）、約氏乳桿菌（Lj）和大腸桿菌（Ec）四種常用益生菌，加入到臨床前黑色素瘤模型的無菌小鼠的日常飲食中，以測試其抗腫瘤潛力。結果顯示，在腫瘤細胞移植（TCE）后1天開始每天口服Bl、Ec或Lr，可有效抑制黑色素瘤的生長，且生存率增加。而Lj未能介導腫瘤抑制，表明共生體抑制腫瘤生長的能力是特定物種的。且Lr是模型中具有最強腫瘤抑制能力的益生菌。通過流式細胞儀對早期（TCE后第9天[pTCE]）、中期（TCE后第11天）和晚期（TCE后第17天）的免疫反應進行分析，評估Lr治療在整個腫瘤發展過程中的全身免疫調節效果。結果顯示，在評估的所有時間點，Lr治療使腫瘤微環境（TME）向抗腫瘤性、免疫刺激性環境傾斜，其特點是產生干擾素γ（IFNγ）的Th1細胞（IFNγ+CD8 T細胞）和Tc1細胞（IFNγ+CD8 T細胞）的擴張，總之，Lr能有效地增強抗腫瘤免疫（圖1）。
圖1. Lr誘導抗腫瘤免疫并促進臨床前黑色素瘤的ICI
瘤內Lr是介導抗腫瘤作用的必要和充分條件
在腸道腫瘤中存在腫瘤微生物組，并且已經從乳腺和胰腺患者的腫瘤中找到了活的細菌。然而，瘤內菌是否是影響腫瘤發展的主動媒介尚不清楚。為此，在Lr選擇性培養基中培養腫瘤勻漿物，并在服用Lr的小鼠的所有腫瘤中均檢測到活的Lr。為了探究Lr如何影響腫瘤微生物組的組成，采用廣譜培養法模擬腫瘤微環境（TME）中的微生物分布，在有氧/厭氧培養條件下使用不同營養成分的肉湯和瓊脂，使各種細菌得以恢復。雖然在對照組小鼠的腫瘤中檢測到了各種活菌，但Lr處理的小鼠腫瘤顯示TME中的微生物多樣性在不斷下降，而Lr逐漸取而代之，表明外源性Lr灌胃驅動轉位并維持腫瘤微生物組。還發現Lr在GF和SPF條件下都會轉位到全身組織，包括肝臟、脾臟和腸系膜淋巴結（MLNs），這意味著Lr通過血管和淋巴途徑轉位。在腫瘤內檢測到口服的大腸桿菌Ec，但未檢測到益生菌Bl，證明細菌轉位到TME并不是Lr所獨有的。總之， Lr轉移到腸道末端腫瘤的機制不受分類學的限制，并且獨立于已建立的微生物群、腫瘤形成和腸道屏障功能障礙。
瘤內（IT）注射單劑量的Lr，并分析其在腫瘤發展過程中的TME豐度，結果顯示，雖然Lr沒有擴大，但在Lr注射后15天內都能從腫瘤中培養出存活的Lr，證明Lr在TME內的定植是持續的；且腫瘤的密度并未隨腫瘤的大小而增加；TME為Lr提供了一個可持續的生態位，腫瘤內的Lr足以促進抗腫瘤免疫；且瘤內注射Lr到已建立的腫瘤中，顯著抑制腫瘤生長，提高腫瘤內Tc1的頻率，并延長生存期。使用氨芐西林（AMP）和萬古霉素（VAN）以評估對瘤內Lr是否是必需的。結果顯示， AMP會消耗Lr；瘤內注射AMP，而非VAN，可減少瘤內Lr。與瘤內注射VAN的Lr處理小鼠相比，瘤內注射AMP的Lr處理小鼠卻無顯著的腫瘤抑制或生存率的改善?？傊?，瘤內Lr的存在是抗腫瘤的充分條件，也是促進抗腫瘤Tc1免疫、抑制腫瘤生長和提高臨床前黑色素瘤生存率所必需的（圖2）。
圖2. 瘤內Lr是介導抗腫瘤作用的必要和充分條件
Lr釋放的I3A是促進抗腫瘤免疫的必要和充分條件
用Lr分別處理YUMM1.7黑色素瘤、MC38結腸腺癌和MMTV-PyMT乳腺癌的小鼠，均顯著抑制腫瘤生長，這表明Lr介導的腫瘤抑制不是黑色素瘤模型所特有的。隨后用熱殺的Lr進行處理，結果顯示，與用活體Lr處理的小鼠相比，口服或瘤內注射熱殺的Lr都不足以抑制腫瘤生長或延長生存期，這表明抗腫瘤機制可能依賴于Lr的代謝活性（圖3）。
圖3. 熱殺的Lr不能誘導腫瘤抑制
Lr已被證明能釋放幾種免疫調節代謝物，其中包括吲哚衍生物I3A，它通過激活芳烴受體（AhR）（一種普遍表達的轉錄因子）而顯示出T細胞免疫調節特性。于是探究Lr釋放的I3A是否在Lr誘導的Tc1介導的抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用，使用敲除芳香族氨基酸轉氨酶基因（Lr ΔArAT）的轉基因菌，其不能將食物中的色氨酸（Trp）分解為I3A。結果發現，與口服Lr WT不同，口服Lr ΔArAT未能抑制腫瘤生長，未能增加存活率也未能引發抗腫瘤Tc1免疫。通過培養用Lr WT或ΔArAT處理的小鼠的腫瘤，結合對腫瘤分離物的菌株特異性PCR，發現兩種Lr菌株都存在，并以類似的水平存活，表明Lr ΔArAT是可以轉位到腫瘤中的，其未能誘導腫瘤抑制或Tc1擴張的原因并不是其不能轉位到腫瘤中。隨后在富含Trp的培養基中對腫瘤來源的Lr分離物進行傳代培養，結果發現，與Lr ΔArAT和對照組處理的小鼠相比，Lr WT處理的小鼠AhR活性和I3A的豐度顯著增加，表明轉位的Lr WT而非ΔArAT在體內將Trp分解成AhR配體I3A。
那么只有I3A是否足以誘發抗腫瘤反應呢？結果表明，口服I3A后可抑制腫瘤生長，并以劑量依賴的方式增加生存率，且I3A足以顯著提高TME中Tc1的豐度和效應器功能。I3A的瘤內注射也導致顯著腫瘤抑制，并以劑量依賴的方式增加存活率，表明I3A可以直接從TME內抑制腫瘤生長。且與單獨使用PD-L1相比，I3A和PD-L1的組合治療導致了腫瘤生長的顯著抑制，接受組合治療的小鼠的腫瘤重量相比對照小鼠顯著下降。總之，Lr產生的I3A是抗腫瘤效應必需的，足以促進腫瘤Tc1的免疫，具有增強ICI的作用（圖4）。
圖4. Lr釋放的I3A是促進抗腫瘤免疫的必要條件和充分條件
I3A通過激活CD8 T細胞內的AhR介導抗腫瘤免疫
已報道AhR激活在使CD4 T細胞分化向Th17或Treg細胞譜系傾斜方面發揮關鍵作用，并以配體依賴的方式進行。通過用來自LrWT或ΔArAT的上清液培養用αCD3和αCD28激活的脾臟新生CD8 T細胞，這兩種細胞分別激活和不能激活AhR，觀察到Lr WT-而非ΔArAT-衍生的上清液能誘導IFNγ的產生，表明Lr釋放的I3A直接作用于CD8 T細胞，促進Tc1功能。轉錄因子富集分析顯示AhR依賴性的基因富集，這些基因含有cAMP反應元件結合蛋白1（Crebp1）的轉錄因子結合點，其中CREB是關鍵的1型效應基因（如IFNγ）的重要轉錄激活因子，在絲氨酸133（Ser133）處進行磷酸化以激活和CREB介導的轉錄。結果顯示，I3A刺激CD8 T細胞導致CREB（pCREB）在絲氨酸133處的磷酸化顯著增加，I3A誘導關鍵的Tc1轉錄因子Blimp1和Tc1效應基因Ifng顯著上調；且I3A以AhR依賴性的方式促進Tc1分化，而AhR拮抗劑則抑制I3A誘導的Tc1命運，且在AhR缺陷的CD8 T細胞中，I3A則不能誘導pCREB以及Tc1轉錄和T細胞效應。構建CD8 T細胞內AhR特異性缺失的小鼠（Ahrf/fCD8 Cre+），結果顯示，在Ahrf/fCD8 Cre+小鼠中，Lr和I3A都不能介導的腫瘤抑制和生存益處，I3A處理未能誘導顯著的Tc1反應，揭示了Lr釋放的I3A介導的腫瘤抑制依賴于CD8 T細胞內的AhR激活。總之，Lr衍生的I3A以CD8 T細胞內在的、AhR依賴的方式促進Tc1分化和效應功能（圖5）。
圖5. I3A通過激活CD8 T細胞內的AhR介導抗腫瘤免疫
高Trp飲食促進免疫治療
鑒于Lrc將飲食中的Trp分解成AhR配體I3A，評估飲食中的Trp水平是否影響Lr介導的抗腫瘤反應。在腫瘤細胞植入前4周，將小鼠置于高Trp或低Trp的飲食中，結果顯示，與低Trp（0.19%）飲食且接受Lr的小鼠相比，高Trp（1.19%）飲食且接受Lr的小鼠呈現顯著腫瘤抑制、生存率增加，表明高Trp的飲食能增強Lr介導的腫瘤抑制。且僅用高Trp的飲食（不用Lr處理）就足以抑制黑色素瘤的生長，并延長小鼠的生存期。此外，單獨使用高Trp的飲食以及高Trp和Lr的組合處理的抗腫瘤效果與TME的AhR活性增加顯著相關，表明高Trp的飲食通過增加TME內的AhR活性促進抗腫瘤反應。在Lr處理的情況下，高Trp的飲食導致腫瘤內I3A的顯著增加。鑒于高Trp飲食的抗腫瘤作用與TME AhR活性的增加相關，評估AhR信號和CD8 T細胞內AhR活性的作用，結果顯示，這兩者對于Trp飲食介導的腫瘤抑制都需要。此外，單獨使用高Trp的飲食顯著增強PD-L1的功效。還發現高Trp的飲食足以在復雜的微生物組存在的情況下介導抗腫瘤反應，這表明除了Lr之外，其他分解Trp的細菌也可能有助于抗腫瘤免疫。總之，高Trp飲食能增強Lr的抗腫瘤作用，而在復合微生物群存在的情況下，僅高Trp飲食就能抑制腫瘤的生長并增強ICI（圖6）。
圖6. 高Trp飲食抑制腫瘤的生長并增強ICI
I3A促進晚期黑色素瘤患者ICI反應和生存
納入晚期四期黑色素瘤患者（n = 42）進行靶向代謝檢測，以確定其基線I3A血清水平以研究I3A在影響人類黑色素瘤ICI療效方面的潛在作用。將這些患者分為對IFNα和PD1組合免疫療法有反應組（n = 19）和無反應組（n = 23）。結果顯示，與無反應組相比，ICI有反應組血清中的外源性I3A濃度顯著增加。將患者按血清I3A水平高（>70分位數）和低（<30分位數）分層，發現全身I3A高的患者與I3A水平低的患者相比，其無進展生存（PFS）和總生存期明顯延長。
由于在晚期黑色素瘤患者中發現了另一個內源性AhR配體——Kyn的血清水平增加，并與不良預后相關，于是評估隊列血清中Kyn的水平。結果表明，與I3A不同，ICI有反應組和無反應組的Kyn水平相似，且當患者按血清高Kyn和低Kyn水平分層時，PFS或總生存率無統計學差異；進一步評估Kyn在模型中的影響，發現Kyn的瘤內注射不能抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長，表明通過激活AhR的腫瘤抑制是配體I3A依賴性的。總之，微生物AhR配體I3A在促進黑色素瘤患者的ICI反應方面發揮著潛在作用，有助于延長PFS和總生存期（圖7）。
圖7. I3A促進晚期黑色素瘤患者ICI反應和生存
小結
本研究發現益生菌Lr會轉移到黑色素瘤內，在黑色素瘤內定植并持續存在，通過釋放膳食色氨酸衍生物I3A（芳烴受體激動劑）激活CD8+T細胞的AhR通路，促進轉錄因子CREB磷酸化，促使其產生IFNγ，以增強ICI，抑制腫瘤大小，延長晚期黑色素瘤患者生存期，改善其預后。證實高色氨酸飲食可增強Lr和ICI誘導的抗腫瘤免疫。最后，在臨床上驗證了I3A促進晚期黑色素瘤患者ICI治療反應和生存。本研究為臨床試驗中測試I3A治療或益生菌和飲食結合療法改善腫瘤免疫治療效果提供理論依據。
參考文獻
Dietary tryptophan metabolite released by intratumoral Lactobacillus reuteri facilitates immune checkpoint inhibitor treatment. Cell. 2023.
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本研究揭示益生菌釋放的I3A可有效增強抗腫瘤免疫并促進ICI效果，并在臨床隊列樣本中利用靶向代謝檢測進行驗證，揭示I3A促進晚期黑色素瘤患者ICI反應和生存。本公司經典的已獲得客戶高度肯定的Q300全定量檢測技術和升級的新品Q1000技術，均可精確捕捉到論文中提到的代謝途徑中所有小分子產物的細微改變，。目前Q300技術已助力客戶在Science, Cell Metabolism, Gut, Advanced Science, Diabetes Care, Nature Communications, PNAS等權威期刊發表近60篇SCI文章，平均IF>10分。
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