佛山市婦幼保健院科研實驗中心自成立以來，一直致力于共生微生物與腫瘤的基礎研究及其臨床應用轉化。最近，本中心蘇冀彥副研究員以第一作者身份在Gut Microbes（中科院一區，Impact factor：12.2）發表題為“Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation”的研究論文（通訊作者為實驗中心主任夏承來研究員、廣東省中醫院陳前軍教授以及廣東省科學院微生物研究所謝意珍研究員）。此外，該研究成果已形成授權中國發明專利一項（專利號：ZL 2022 1 1572648.7）。（麥特繪譜提供個性化靶向定制檢測服務）
在本論文中，我們首先發現乳腺癌患者腸道菌群的α-多樣性和β-多樣性也與良性乳腺疾病患者有顯著差異。在構成該差異的特異性微生物物種中，Prevotella屬的相對豐度和流行率均顯著高于對照組患者，且其在65歲以下乳腺癌患者中的相對豐度和流行率仍顯著高于對照組人群。已有文獻報道， Prevotella copri是Prevotella屬中最為常見的一個種，也廣泛存在于人腸道微生物中。我們進一步分析發現，P. copri在所有年齡段和65歲以下乳腺癌患者中的相對豐度和流行率也顯著高于對照組。有趣的是，課題組更早發表的論文也表明乳腺癌荷瘤小鼠的腸道菌群也含有更高豐度的Prevotella屬，提示P. copri的富集與乳腺癌的發生發展密切相關。
圖1. 乳腺癌患者腸道菌群多樣性有別于良性乳腺疾病患者，且其中P. copri異常富集，提示P. copri的富集與乳腺癌的發生發展密切相關
基于上述臨床分析結果，課題組進一步觀察P. copri屬對乳腺癌發展的具體作用。課題組分別在無特定病原體(Specific pathogen-free，SPF)小鼠和無菌(Germ-free，GF)小鼠中構建4T1乳腺癌模型，觀察灌胃給予P. copri(2.5×109cfu/mouse，每周1次)對腫瘤組織生長的影響。結果發現，無論在SPF小鼠還是GF小鼠中，灌胃給予P. copri均可顯著促進4T1細胞形成的腫瘤的生長，其腫瘤生長速度、最終瘤重均顯著提高，且最終P. copri在SPF小鼠糞便和小腸內容物的微生物中的殘余比例更高，更在GF小鼠糞便微生物中占據絕對地位。
圖2. 過量P. copri的定植可促進乳腺癌荷瘤小鼠的腫瘤組織生長
然而有趣的是，課題組發現P. copri的分泌物無法直接促進乳腺癌細胞生長。但我們通過靶向代謝組學分析發現，通過灌胃給予P. copri使其在宿主體內過量定植，可使SPF荷瘤小鼠和GF荷瘤小鼠血清中吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvic acid，IPyA）急劇降低，且下降幅度最大，同時其前體色氨酸(Tryptophan，Trp)也在SPF小鼠中顯著下降。Trp是人體無法自身合成的必須氨基酸之一，在人體內其主要由腸道微生物中的色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylases，Tph)代謝為IPyA。課題組通過體外實驗證明，P. copri可大量代謝Trp而生成極少量的IPyA。同時，我們通過動物實驗證明，灌胃給予IPyA（120mg/kg，每天1次）可以明顯抑制SPF荷瘤動物的腫瘤生長。上述結果表明，P. copri促進乳腺癌生長的過程中伴隨著宿主體內IPyA的劇減，提示我們P. copri的過量定植可耗竭宿主IPyA，從而顯著削弱宿主抑制乳腺癌細胞生長的能力，促進乳腺癌生長。
圖3. P. copri的過量定植可耗竭宿主IPyA，從而顯著削弱宿主抑制乳腺癌細胞生長的能力，促進乳腺癌生長
課題組進一步發現，在與生理濃度接近的實驗濃度下（約2mM），IPyA對鼠源乳腺癌細胞株4T1有直接細胞毒作用，抑制其增殖和克隆形成能力。此前，課題組通過蛋白組學和簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術(Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)發現P. copri使腫瘤組織的變化集中在UHRF1調控的AMPK通路上。另一方面，在IPyA誘導乳腺癌細胞死亡的過程中，IPyA可使細胞中UHRF1，DMMT3A和DNMT1表達下調，促進AMPK磷酸化。IPyA也對細胞中AMPK通路相關基因mRNA水平產生影響，其中使cftr的mRNA水平下調，而使pfkfb3, pparg, scd1和lepr的mRNA水平上調。此外，我們還發現cftr的啟動子區域的甲基化水平被IPyA上調，與其mRNA水平下調的情況相互吻合。
圖4. IPyA對乳腺癌細胞有直接細胞毒作用
Xu等（Cell Res, 2022. 32(1): 54-71，doi：10.1038/s41422-021-00565-y）發現UHRF1是AMPK活性的關鍵負調控因子。在本課題中，我們發現IPyA抑制了UHRF1和PP2A C的核內分布，同時提高了細胞總體的AMPK磷酸化水平，與Xu等的發現相符。此外，我們還發現IPyA在促進細胞內AMPK磷酸化的同時，線粒體磷酸化（Mitochondrial oxidative phosphorylation）途徑生成的ATP（mitoATP）和糖酵解（Glycosis）途徑生成的ATP（glyATP）均大量減少，導致細胞總ATP生成急劇下降；同時，mitoATP的占比明顯下降而glyATP占比明顯上升，這些正是AMPK被激活的表現。綜上所述，IPyA可通過逆轉UHRF1介導的負調節，激活AMPK，對癌細胞進行能量代謝重編程，抑制細胞能量生成，從而抑制細胞增殖。最后，課題組在另一個鼠源乳腺癌系中再次驗證了P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用。以上結果表明，IPyA對腫瘤細胞的細胞毒作用與P. copri對乳腺癌促進作用完全相反。此前已經證明P. copri的增多導致了IPyA耗竭，這正是P. copri促進乳腺癌進展的關鍵原因。
圖5. IPyA可通過逆轉UHRF1介導的負調節，激活AMPK，對癌細胞進行能量代謝重編程，抑制細胞能量生成，從而抑制細胞增殖
圖6. P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用在另一個鼠源乳腺癌細胞系EMT-6中再次得到驗證
本研究獲國家自然科學基金（青年基金項目和面上項目）、福建省自然科學基金、佛山市科技局、佛山市登峰計劃資助。
參考文獻：
[1]Su, J., et al. (2024). Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation. Gut Microbes, 2024. 16(1): 2347757.
[2]Xu, X., et al. (2022). Nuclear UHRF1 is a gate-keeper of cellular AMPK activity and function. Cell Res 32(1): 54-71.
供稿：蘇冀彥副研究員
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