食管鱗狀細胞癌（ESCC）患者常因淋巴結轉移而面臨嚴峻預后。然而，關于ESCC轉移性淋巴結的細胞和分子特性的全面理解仍然難以實現。在這項涉及12名轉移性ESCC患者的研究中，我們采用了單細胞測序、空間轉錄組學（ST）和多重免疫組化學（mIHC）技術，探索原發腫瘤樣本、鄰近組織、轉移性和非轉移性淋巴結的空間和分子屬性。對161333個細胞的分析顯示，上皮細胞中有特定亞簇在轉移性淋巴結中顯著富集，表明具有促轉移特性。此外，腫瘤微環境中的間質細胞，包括MMP3+IL24+成纖維細胞、APLN+內皮細胞和CXCL12+周細胞，也被認為通過血管生成、膠原蛋白生成和炎癥反應參與ESCC轉移。處于循環狀態的CD8+ T細胞在轉移性淋巴結中尤為常見，表明其在促進轉移中具有潛在作用。我們識別出不同的細胞間通信網絡和特定的配體-受體通路。我們的發現通過空間轉錄組圖譜和mIHC得到了驗證。本研究加深了我們對ESCC患者轉移性淋巴結細胞和分子層面的理解，為這些患者提供潛在的新治療策略見解。

scRNA-seq、Visum

1.通過scRNA測序和空間轉錄組學揭示的ESCC表征

為全面闡明ESCC的細胞特性，我們對12名ESCC患者通過手術獲得的29個樣本進行了scRNA-seq分析，包括12個腫瘤樣本、6個鄰近正常組織、4個轉移性淋巴結和7個非轉移性淋巴結（圖1a）。共計對161333個高質量細胞進行了以下分析，其中61928個細胞來自腫瘤樣本，29518個來自鄰近正常組織的細胞，49966個來自淋巴結的細胞，以及19921個來自轉移性淋巴結的細胞。根據已知標志物鑒定了12種主要細胞類型（圖1b，c），包括T細胞、B細胞、漿細胞、肥大細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、周細胞、成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞。此外，我們的結果顯示，T細胞的分數和B細胞在淋巴結中的比例遠高于其他樣本，而轉移性淋巴結中上皮細胞的比例最高（圖1d）。此外，利用一名轉移性ESCC患者的腫瘤樣本，揭示了ESCC的空間轉錄組特征，并在ST切片上標注了每種主要細胞類型（圖1e）。總體而言，我們揭示了ESCC組織的細胞組成和空間特征，便于后續對轉移相關細胞亞群的分析。

2.轉移性ESCC中具有促進轉移特征的上皮細胞

從腫瘤樣本、正常組織和轉移性淋巴結中識別出16416個惡性上皮細胞。共分類了3個上皮細胞亞簇，其中大多數起源于腫瘤樣本和轉移性淋巴結（圖2a，b）。大多數來自鄰近組織的上皮細胞為ME1亞簇，表明ME1亞簇的惡性潛力相對較低。ME2和 ME3亞簇主要從腫瘤樣本和轉移性淋巴結中采集，表明ME2和ME3亞簇可能具有較高轉移潛力。與鄰近組織獲得的上皮細胞相比，轉移性淋巴結獲得的上皮細胞CNV評分遠高于此（圖2c）。每個亞簇的關鍵標記基因如圖2d。此外，我們的發現顯示ME1亞群在三個亞群中惡性評分最低，非惡性分數最高，這意味著ME1亞群的惡性潛能較低（圖2f）。我們評估了這些基因在上皮細胞中的表達水平，這些基因來自ESCC、鄰近組織和轉移性淋巴結，隨后選擇了在轉移性淋巴結中高度表達的基因作為促轉移基因（圖2e）。與轉移性淋巴結的功能相比，顯示原發腫瘤的藥物代謝和耐藥性高度富集（圖2g）。在組織學層面，腫瘤區域在H&E圖像和ST特征圖中確定（圖2h）。根據促轉移特征，識別出特定的轉移相關區域，并在轉移相關區域周圍發現血管，表明新血管的招募可能是ESCC轉移的關鍵。mIHC圖像顯示，上皮細胞的標記基因（EPCAM、DSP和TXNRD1）在腫瘤區域，尤其是轉移相關區域高度表達（圖2i）。通過空間分析和mIHC驗證了所選基因，上述結果顯示TXNRD1在促轉移區域高度表達。

3.mCAF1（MMP3+IL24+）通過降解細胞外基質促進血管新生，促進了ESCC轉移

細胞外基質（ECM）在塑造癌癥進展和促進轉移中發揮顯著作用。隨后，我們研究了癌癥相關成纖維細胞（CAFs）的亞群。根據先前的研究，我們將14248個CAFs歸為兩個主要亞群：iCAF和mCAF（圖3a）。iCAF亞簇主要富含生長因子，包括WNT和NF-kB通路（SFRP1和NFKBIZ），以及一些趨化因子標記（CXCL1和CCL2），而mCAF亞簇則顯著積累了POSTN基因（圖3b）。隨后共識別出四個mCAF亞簇和六個iCAF亞簇，并發現不同亞簇的表達譜（圖3b）。

一些CAF亞簇同時富集于轉移性淋巴結和原發腫瘤部位，如mCAF1（MMP3+IL24+）和mCAF4，表明這些亞簇可能在促進ESCC轉移中發揮關鍵作用（圖3c）。為進一步探討這些CAF亞簇如何促進轉移，我們發現mCAF1中MMP1和MMP3的表達水平顯著高于其他亞群（圖3d）。MMP3可能降解基底膜和ECM，為腫瘤發生和轉移提供條件。與MMP3的功能類似，p53的功能障礙可能提高MMP1表達，進而加劇肺腺癌的轉移。CXCL8的表達水平在mCAF1中也明顯高于其他亞簇。此外，我們發現抗血管生成基因（如HIF1A）和缺氧相關基因（如ADM）在mCAF1中表達較高（圖3e）。功能分析還顯示血管生成主要富含mCAF1（圖3f）。通過ST和mIHC驗證了mCAF1區域及相關標記基因，樣本取自轉移性ESCC，顯示mCAF1在TME的間質區中富集（圖3g，h）。mCAF1亞簇也包圍了ST特征圖中的促轉移區域，表明mCAF1亞簇參與了ESCC轉移（圖3g）。本研究提出，mCAF1促進的腫瘤微環境中ECM和血管生成的降解可能促成ESCC轉移。

4.SOX4和SOX11通過再生血管生成和膠原蛋白生成驅動APLN+內皮細胞趨向促進轉移表型

內皮細胞是ECM的重要組成部分。3325個內皮細胞分為4個簇，包括1個動脈內皮細胞（AEC）亞簇、2個毛細血管內皮細胞（CEC）亞簇、4個血管內皮細胞（VEC）亞簇和1個淋巴內皮細胞（LEC）亞簇（圖4a）。我們的發現顯示，CEC亞簇中積累了與毛細血管功能（如RGCC和PLVAP）相關的基因（圖4b）。我們發現CEC亞群，尤其是CEC2，在原發腫瘤樣本和轉移性淋巴結中占優，表明CEC2可能在ESCC轉移中起關鍵作用（圖4c）。

為了進一步探討CEC2在轉移性ESCC中的作用，我們發現APLN和APLNR在CEC2（又稱APLN+內皮細胞）中表達較高（圖4d）。APLN通常被視為與再生血管生成相關的重要生物標志物，可能使內皮細胞從成熟狀態轉變為增殖狀態。此外，COL4A1和COL4A2在CEC亞簇中表達較高，尤其是在APLN+內皮細胞中，表明這些亞簇在生成膠原蛋白中起著重要作用（圖4c）。膠原蛋白粘連是癌癥侵襲和轉移過程中發生的復雜機制，這可能是APLN+內皮細胞的潛在功能。此外，COL4A1還可能激活FAK-Src信號通路，進而促進癌癥進展和轉移。

隨后，我們進行了SCENIC檢測APLN+內皮細胞的上游轉錄因子，這些因子可能驅動APLN+內皮細胞形成促轉移表型。SOX4和SOX11是APLN+內皮細胞中上調最顯著的轉錄因子之一（圖4f）。SOX4主要與膠原蛋白生成相關（如CXCR4、COL4A1和COL4A2），而SOX11調控與再生血管生成相關的基因（RGCC和APLN），進一步促進了內皮細胞向TME促轉移表型的分化（圖4e）。通過mIHC圖驗證了SOX4和SOX11的調控網絡（圖4g）。此外，ST特征圖和解卷積分析結果顯示，APLN+內皮細胞環繞著腫瘤細胞的促轉移區域，關鍵標志基因的表達水平高度表達（圖4h-i）。mIHC圖被用來進一步驗證結果，顯示了ESCC中APLN+內皮細胞的促轉移特性（圖4j）。

5.由平滑肌細胞形成的不連續血管和由PC1（CXCL12+）激活的炎癥反應促進ESCC轉移

ESCC共將2191個細胞分為4個PC亞群和5個SMC亞群（圖5a）。大多數SMC亞簇在轉移性淋巴結中的比例顯著減少，以PC1亞簇為主（圖5b）。SMCs是血管的關鍵組成部分，對于細胞周，轉移性淋巴結中PC1的比例顯著較高，暗示PC1亞簇在ESCC轉移中可能起作用（圖5c）。我們的發現顯示，CXCL12在PC1亞簇中表達較高，表明PC1可能激活轉移性ESCC中的特定炎癥通路（圖5c，d）。接著，我們識別出一些在PC1亞簇中顯著富集的通路，如IL-17信號通路、NF-κB信號通路和TNF信通路（圖5e）。使用ST特征圖、mIHC圖以及去卷積分析結果驗證（圖5f–h）。

6.處于循環狀態的耗盡CD8+ T細胞可能是促轉移腫瘤微環境的重要組成部分

識別并分類了25816個CD8+ T細胞，分為六個亞簇（圖6a）。循環和耗盡的CD8+ T細胞在腫瘤樣本和轉移性淋巴結中相對豐富（圖6b）。我們將耗盡的CD8+ T細胞（CD8-TEX）分為兩個亞組，正常狀態的CD8+ T細胞（CXCL13+MKI67-）和循環狀態的CD8+ T細胞（CXCL13+MKI67+）（圖6c）。為了進一步探討轉移性ESCC中CD8+ T細胞的動態過渡過程，構建了CD8+ T細胞狀態軌跡的擬時間圖譜。該軌跡以初生CD8+ T細胞（CD8-TN）、中央記憶CD8+ T細胞（CD8-TCM）、效應記憶CD8+ T細胞（CD8-TEM）和效應CD8+ T細胞（CD8-TEMRA-TEFF）為CD8-TN與CD8-TEF之間的過渡狀態，最終達到循環-CD8-TEX的最終分化狀態（圖6d）。我們評估了每個CD8+ T細胞亞簇的耗盡水平，表明Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX得分最高（圖6e）。免疫檢查點抑制劑（ICI）被認為是癌癥治療的重要靶點，其中一些抑制性受體與T細胞耗盡相關。我們分析了5個ICI在不同CD8+ T細胞亞簇中的表達水平，發現ICI在Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX中表達較高，表明這兩個亞群的耗盡狀態（圖6f）。為了進一步探討淋巴結轉移的獨特細胞相互作用，我們分析了正常和轉移淋巴結中的細胞間差異性通訊（圖6g）。與正常淋巴結相比，CD70-CD27和IL4-IL4R相互作用被顯著識別，這些相互作用可能激活CD8-TEX，進而抑制腫瘤微環境。

最新研究已證明ESCC免疫細胞的獨特特征。然而，尚未對ESCC中轉移性和非轉移性淋巴結的單細胞層面微環境進行深入研究。本研究中，我們使用了來自12名ESCC患者的29份樣本，包括腫瘤樣本、鄰近正常組織、轉移性和非轉移性淋巴結，全面展示了轉移性ESCC在單細胞層面微環境中的細胞和分子特征。我們構建了空間轉錄組圖譜，并利用mIHC圖像進一步探討ESCC轉移機制，驗證了scRNA-seq的發現。scRNA-seq和ST的整合為開發和應用轉移性ESCC的新治療策略奠定了基礎。

由于轉移仍是癌癥預防和治療中的重大挑戰，揭示TME的細胞和分子特性對于了解ESCC淋巴結轉移情況至關重要。鑒于腫瘤細胞的固有異質性，識別與轉移相關的獨特上皮細胞亞群的任務極具挑戰性。以往研究已識別出促進腫瘤轉移的特定上皮細胞亞簇，而在ESCC15,43中尚未發現促進轉移的關鍵亞簇。根據我們的研究，表現出促轉移特征的上皮細胞在轉移性淋巴結中數量豐富，這些淋巴結在ESCC中可能具有顯著的轉移潛力。我們的研究結果還顯示，轉移性淋巴結的耐藥性和藥物代謝功能并未顯著富集，表明這些上皮細胞亞群具有促進轉移的特性。在組織學層面，我們已根據促轉移特征識別出轉移相關區域。值得注意的是，觀察到這些特定區域周圍有血管，表明新血管的招募可能在ESCC轉移中起關鍵作用。

總之，我們提供了關于ESCC轉移中涉及的空間模式和不同細胞成分的獨特視角和關鍵信息。我們已鑒定出在ESCC中表現出促進轉移特性的特定上皮細胞，這些細胞可能成為轉移的主要起始因子。此外，需要更多關注間質細胞，包括成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和周圍細胞，因為它們可能通過調節血管生成和影響細胞外基質的形成，在促進轉移中發揮關鍵作用。此外，最近發現腫瘤微環境中的多種免疫細胞積極促進ESCC轉移。最近發現的促轉移細胞成分以及腫瘤微環境中獨特的細胞間通訊，將對開發轉移性ESCC的有效治療策略至關重要。

參考文獻：

Guo W, Zhou B, Dou L, Guo L, Li Y, Qin J, Wang Z, Huai Q, Xue X, Li Y, Ying J, Xue Q, Gao S, He J. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics of esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastases. Exp Mol Med. 2025 Feb;57(1):59-71. doi: 10.1038/s12276-024-01369-x. Epub 2025 Jan 1. PMID: 39741182; PMCID: PMC11799171.