口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是頭頸部常見的癌癥類型，每年有近70萬新發病例和38萬死亡病例。目前，基于病理診斷和腫瘤分期，OSCC主要采用手術、化療、放療聯合治療，其有效臨床治療仍然是一個挑戰，尚需開發有效的新藥。在不同的腫瘤中，苯乙雙胍已被證明比二甲雙胍具有更強的抗腫瘤活性，然而，苯乙雙胍對OSCC細胞的影響尚不清楚。2024年5月8日，山東大學吳訓偉/郭涇團隊在“International Journal of Oral Science，IF 14.9”上發表論文Phenformin activates ER stress to promote autophagic cell death via NIBAN1 and DDIT4 in oral squamous cell carcinoma independent of AMPK。研究發現苯乙雙胍誘導其新靶點DDIT4，特別是NIBAN1，促進細胞自噬和凋亡，從而抑制OSCC細胞的生長。本研究進一步支持了苯乙雙胍的抗癌作用，為其在OSCC臨床治療中的發展提供了堅實的基礎。
研究結果
1、在體內外實驗中，苯乙雙胍通過抑制OSCC細胞增殖、增強OSCC細胞凋亡和自噬來抑制OSCC的生長
研究發現苯乙雙胍在體內外均能顯著抑制OSCC細胞的生長，通過研究苯乙雙胍對OSCC細胞增殖和死亡的影響，發現苯乙雙胍治療可以減少體外OSCC細胞的增殖，明顯提高細胞凋亡率；Western blot分析凋亡細胞中激活的caspase通路，進一步驗證了苯乙雙胍誘導細胞凋亡的作用。qRT-PCR分析發現苯乙雙胍處理OSCC細胞中p62、ATG7、Beclin-1、ATG12和Lamp-1 mRNA水平顯著升高。此外，OSCC細胞轉染GFP標記的LC3，然后用苯乙雙胍處理，GFP細胞的點狀染色顯著增加，這些數據表明苯乙雙胍可以促進OSCC自噬。進一步研究發現苯乙雙胍通過誘導自噬體的形成來促進OSCC細胞自噬。
已有研究表明自噬可以誘導細胞凋亡，因此作者研究了苯乙雙胍誘導的自噬是否可以促進細胞凋亡。自噬基因Beclin-1的敲低不僅可以阻斷自噬的誘導，還可以降低苯乙雙胍誘導的凋亡標志物的表達，提示苯乙雙胍通過誘導自噬促進OSCC細胞凋亡。敲低Beclin-1可以恢復苯乙雙胍誘導的OSCC生長抑制，提示苯乙雙胍誘導自噬可促進體外OSCC細胞死亡。作者進一步在體內驗證了這一結果，數據表明苯乙雙胍不僅抑制OSCC細胞增殖，而且促進OSCC細胞凋亡和自噬，從而在體外和體內抑制OSCC細胞的生長。
圖1.苯乙雙胍在體外促進OSCC細胞的細胞自噬
2、苯乙雙胍通過調控DDIT4和NIBAN1的表達誘導自噬的形成
為進一步了解苯乙雙胍調節哪些信號通路來抑制OSCC細胞生長，作者對苯乙雙胍處理的CAL 27 OSCC以及對照細胞進行了RNA-seq分析，發現自噬信號通路的激活是苯乙雙胍對OSCC細胞的主要影響，RNA-seq分析發現了兩個重要基因DDIT4和NIBAN1，苯乙雙胍處理顯著誘導其表達。接下來，為確定苯乙雙胍是否通過高水平表達DDIT4和/或NIBAN1來促進自噬，進行DDIT4和/或NIBAN1敲低處理，發現敲低DDIT4顯著抑制了苯乙雙胍誘導的p62、Beclin - 1、ATG7和自噬標志物的表達，NIBAN1敲低以及DDIT4和NIBAN1雙敲低后也獲得了類似的結果，表明苯雙胍通過調節DDIT4和NIBAN1的表達來促進自噬。據報道，DDIT4可負向調控mTOR通路，而NIBAN1可與mTOR通路相互作用，調控細胞凋亡和自噬。作者發現苯乙雙胍抑制了OSCC細胞的mTOR通路，進一步實驗發現苯乙雙胍通過抑制mTOR信號通路誘導DDIT4和NIBAN1表達，促進細胞自噬。機制上，苯乙雙胍通過正向調節ATF4而非ATF3來促進DDIT4和NIBAN1的表達誘導自噬，并且這種調節不依賴于AMPK的激活。
圖2. 抑制DDIT4和NIBAN1表達可阻斷苯乙雙胍誘導的自噬
3、苯乙雙胍直接誘導內質網應激，控制ATF4-DDIT4和NIBAN1的表達
接下來，作者證實了AMPK的敲低并不會抑制苯乙雙胍處理誘導的ATF3或ATF4的表達。ATF4是一種應激反應基因，在體外，二甲雙胍已被證明通過增加BIP、DDIT3和caspase-12的表達來激活內質網應激。因此，作者假設苯乙雙胍通過激活內質網應激直接增加ATF4的表達。研究發現苯乙雙胍可以誘導內質網應激激活PERK，而PERK的激活導致其下游靶點eIF2α的激活，從而增加了ATF4的翻譯。進一步實驗表明苯乙雙胍誘導內質膜應激直接激活翻譯機制，增加ATF4的表達，從而控制DDIT4和NIBAN1，促進自噬形成，導致細胞凋亡增加，最終抑制OSCC細胞生長。
圖3.苯乙雙胍通過調節內質網應激誘導ATF4、DDIT4和NIBAN1的表達
小結
綜上，本研究確定了苯乙雙胍的兩個新靶點：DDIT4以及NIBAN1，并發現苯乙雙胍不依賴AMPK的激活，而是誘導內質網應激進而激活PERK / eIF2α / ATF4軸通路，增強DDIT4和NIBAN1的表達，導致mTOR抑制，促進自噬，從而抑制OSCC細胞的生長。研究結果進一步支持了苯乙雙胍的抗癌功能，并為將來開發苯乙雙胍用于OSCC的臨床治療提供了堅實的基礎。