葡萄糖和谷氨酰胺是維持細胞內能量生成和生物合成的兩大營養物質。葡萄糖是碳的主要來源，而谷氨酰胺不僅提供碳，還提供氮，是合成各種生物化合物如嘌呤和嘧啶核苷酸、6-磷酸葡萄糖胺和非必需氨基酸所必需的原料。谷氨酰胺通過谷氨酸轉化為α-酮戊二酸 (α-KG)，α-KG作為谷氨酰胺衍生碳進入TCA循環途徑。谷氨酰胺酶(GLS)將谷氨酰胺的γ-氮清除生成谷氨酸和游離氨，是谷氨酰胺回補的限速步驟。GLS1在癌癥中經常出現失調，其表達被c-Myc正向調控，提高c-Myc水平會在核苷酸生物合成途徑中誘導磷酸核糖焦磷酸酰胺轉移酶（PPAT）的表達，它將谷氨酰胺的γ-氮轉移到5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP），而這是嘌呤生物合成的關鍵限速反應。雖然谷氨酰胺分別受到GLS1分解代謝和PPAT合成代謝的直接影響，但谷氨酰胺與腫瘤惡性程度的關系仍有待闡明。日本九州大學Keiichi I. Nakayama團隊利用靶向蛋白質組學（iMPAQT）與代謝組學分析結合穩定同位素標記谷氨酰胺檢測小細胞肺癌（SCLC）等癌癥代謝全貌，相關成果發表于《Nature Communications》。

蛋白質組和代謝組變化全貌

本研究首先通過將hTERT、SV40早期區域和c-Myc (TSM)導入正常人源二倍體成纖維細胞系TIG-3中建立轉化細胞（TSM），將在三維（3-D）培養基中生長的TSM克隆在2-D培養基中擴增以獲得AIG（錨定非依賴性生長）-1、AIG-2和AIG-3細胞，TSM到AIG-3的惡性進展與c-Myc表達增加有關（圖1e-f）。

對TSM及AIG-1、AIG-2和AIG-3細胞進行iMPAQT分析，共檢測到342種代謝酶。與TSM細胞相比，AIG-3細胞中某些糖酵解酶如己糖激酶2（HK2）、烯醇酶1（ENO1）和乳酸脫氫酶A（LDHA）的豐度增加，且葡萄糖攝取也增加（圖2a），表明Warburg效應在AIG-3細胞中更為明顯。GO富集分析顯示，AIG-3細胞中受影響最大的生物學過程是核酸生物合成途徑（圖2b），核苷酸從頭和回補途徑涉及的大多數酶的數量（如PPAT）都是協同增加的，但谷氨酰胺回補通路限速酶GLS1被下調（圖2c-d），而丙酮酸脫氫酶E1α亞基（PDHA1）（氧化丙酮酸從而導致TCA回補）則被上調（圖2c-d）。為了驗證蛋白質組水平觀察到的葡萄糖代謝變化，本研究采用[¹³C₆]葡萄糖進行同位素分析（圖2e），結果顯示，與TSM細胞相比，AIG-3細胞檸檬酸、天冬氨酸、谷氨酸的¹³C標記效率和代謝物池大小顯著增加（圖2f–h），尤其是檸檬酸、天冬氨酸和谷氨酸的M+2增加與AIG-3細胞中PDHA1介導的丙酮酸的碳源增加是一致的。在癌癥惡性進展過程中，依賴谷氨酰胺作為關鍵底物的核苷酸從頭生物合成途徑中的PPAT水平和進入TCA循環的谷氨酰胺回補途徑中的GLS1水平在惡性進展中以相互作用方式進行調節。在AIG-3細胞中PPAT表達基因受c-Myc調控而表達上調（圖1e），相反GLS1 mRNA表達下調。

為了證實蛋白質組水平觀察到的谷氨酰胺代謝的變化，在TSM和AIG-3細胞中對[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺進行同位素分析(圖3a)。TSM和AIG-S在2D培養物中的細胞生長（圖3b）或[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺摻入以及¹⁵N和¹³C標記的谷氨酸和天冬氨酸產物（圖3c e）都沒有顯著差異。穩態下的標記效率可以反映許多代謝反應的活性卻很難評估對單個反應的影響，因此，作者評估了標記后早期（0.25h）和晚期（6h和24h）對每個反應的標記效率。在TSM或AIG-3細胞中均未檢測到¹³C標記的IMP、AMP、GMP或UMP，而相比TSM細胞，在標記后6h和24h，AIG-3細胞核苷酸從頭生物合成途徑中¹⁵N標記的IMP（圖3f）、AMP（圖3g）、GMP（圖3h）和UMP（圖3i）顯著增加。在AIG-3細胞中，IMP氮標記效率不僅在M+1和M+2組分中增加，而且在M+3中也增加（圖3f），表明源于[¹⁵N]谷氨酰胺的[¹⁵N]天冬氨酸也有助于此標記（圖3e）。與TSM細胞相比，AIG-3細胞中¹⁵N核苷酸（IMP、AMP、GMP和UMP）標記效率提高（圖3f-i）與其池的減小有關?？紤]到AIG-3細胞中核酸合成酶的顯著上調和核苷酸標記效率的顯著提高，這些細胞中核苷酸代謝物池的減小可能是由核苷酸合成速率的增加所致。

在含有人體血漿生理濃度氨基酸的培養基中培養5天后，用0.6 mM [¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺標記TSM和AIG-3細胞，AIG-3細胞對AMP和GMP的¹⁵N標記效率顯著高于TSM細胞。在標記后0.25h基本上未檢測到¹⁵N核酸代謝物，這表明在早期由GLS1介導的谷氨酰胺回補反應主要負責α-KG和富馬酸的產生。標記6h或24h后兩種細胞中α-KG和富馬酸鹽的¹³C標記效率沒有差異（圖3j-k），表明在該時間點這些代謝物反映了源自GLS1和PPAT依賴途徑的總和。與TSM細胞相比，AIG-3細胞在0.25h時α-KG和富馬酸標記效率顯著降低（圖3j-k），表明AIG-3細胞中GLS1活性降低。綜上，蛋白質組學和代謝組學數據一致表明，在實驗癌細胞模型惡性轉化過程中，谷氨酰胺的命運基本上從TCA循環轉移到核苷酸從頭生物合成途徑。

PPAT-GLS1平衡決定著谷氨酰胺命運

在惡性轉化過程中，PPAT表達的增加和GLS1表達的減少導致PPAT/GLS1比值增加。為了研究這兩種酶之間的平衡是否對細胞增殖具有決定性作用，作者檢測了AIG-3細胞中GLS1過表達的影響（圖4a）。在[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺代謝組學分析中以酶促失活的GLS1突變體（S286A）作為對照，強制表達GLS1導致α-KG標記率增加，而IMP（圖4b）、AMP、GMP、谷氨酸和天冬氨酸標記率降低。AIG-3細胞在2-D（圖4c）或3-D（圖4d）培養基中的增殖速率也由于GLS1過表達而顯著降低。且用GLS1抑制劑CB-839處理可逆轉GLS1過表達并抑制AIG-3細胞增殖（圖4c）。總的來說，GLS1的過度活化會抑制腫瘤生長。

作者分析了短發夾RNA（shRNA）介導的RNA干擾對AIG-3細胞PPAT耗竭的影響（圖4g）。PPAT的消耗顯著抑制 [¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺中¹⁵N標記的IMP、AMP和GMP（圖4h），卻增加了¹³C 標記的α-KG（圖4h）。在對照和PPAT缺失的AIG-3細胞中谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的標記效率、池大小和同位素分布無顯著差異。PPAT的消耗也降低了AIG-3細胞在2-D（圖4i）或3-D（圖4j）培養基中增殖速率。此外，與對照細胞相比，PPAT缺失的細胞在裸鼠中形成的腫瘤更?。▓D4k）。由此表明PPAT活性降低會抑制腫瘤生長，GLS1和PPAT之間的平衡控制著谷氨酰胺衍生的碳和氮代謝從而調控細胞增殖和腫瘤生長。

PPAT-GLS1平衡可作為潛在的治療靶點

PPAT和GLS1之間的平衡對人類癌細胞系增殖具有決定性作用。當GLS1或PPAT分別過表達時，A549和HeLa兩種細胞體內外均可被抑制或促進，而A549和HeLa細胞中GLS1缺失則不影響其在2-D培養基中的增殖，也不影響裸鼠腫瘤形成，相反，兩種細胞系中PPAT缺失抑制了其在2-D和3-D培養基中的增殖，并抑制裸鼠腫瘤的形成。不同類型腫瘤細胞對谷氨酰胺代謝的依賴性會有所不同，作者對118個來自不同人體組織的癌細胞系的包括GLS1和PPAT在內的代謝酶豐度進行檢測分析，發現PPAT/GLS1比值在這些細胞類型之間均存在顯著差異(圖5a)。PPAT/GLS1比值高的細胞如BT-549乳腺癌細胞(圖5b)，TGW神經母細胞瘤細胞(圖5c)和U-251 MG膠質母細胞瘤細胞(圖5d)，對PPAT缺失或GLS1過表達敏感；相反，GLS1耗竭或PPAT過表達并不能持續增加這些細胞的AIG。相反，PPAT/GLS1比值低的細胞如HCT116結直腸癌細胞（圖5e）和HSC-60胃癌細胞（圖5f），PPAT耗竭或GLS1過表達對AIG具有促進作用（HCT116）或沒有影響（HSC-60），而GLS1耗竭或PPAT過表達顯著抑制了兩種細胞系的生長。接下來，檢測在生理培養基中培養的這些癌細胞系是否對CB-839敏感，結果顯示在生理條件下CB-839只有對HCT116大腸癌細胞（圖5m）和HSC-60胃癌細胞（圖5n）生長具有顯著抑制作用，表明胃腸來源的癌細胞基本上依賴于谷氨酰胺的回補?？傮w而言，谷氨酰胺的調節可能對多種癌癥具有治療價值，其潛在的抗腫瘤作用可能通過內源性GLS1和PPAT的表達水平來預測。

PPAT與癌癥預后密切相關

PPAT-GLS1平衡影響細胞和小鼠的癌癥惡性程度，同時作者檢測了肺、腦或神經內分泌癌癥患者單組群PPAT和GLS1基因表達與總生存率的關系。在每個隊列中，PPAT高表達的個體預后明顯差于PPAT低表達的個體，而GLS1低表達的個體往往較GLS1高表達的個體預后差，這些差異在神經內分泌癌癥患者中最為顯著。隨后，作者對1.1萬名癌癥患者隊列的所有代謝酶進行綜合薈萃分析，在這些合并的癌癥隊列中，發現嘌呤從頭生物合成途徑的許多酶在其基因表達水平和總體存活率方面具有較高的危害比（HR）（圖6a）。而在隨機效應模型和固定效應模型中，PPAT的HR在組織特異性隊列中都非常高，如肺癌、乳腺癌、腦癌、造血癌、神經內分泌癌、肝癌或胰腺癌隊列（圖6b），而除結直腸癌外，GLS1的表達與其他癌癥的預后均無顯著相關性。但在神經內分泌癌中，PPAT和GLS1的表達分別與預后不良（HR = 5.21）或預后好（HR = 0.38）顯著相關（圖6b）。PPAT/GLS1比值的影響略小于單獨使用PPAT的影響，這表明PPAT的正面作用和GLS1對HR的負面作用并非一一對應。在細胞、小鼠、人類隊列研究的觀察結果表明，PPAT-GLS1平衡調節細胞增殖和惡性腫瘤，而PPAT的表達水平是許多癌癥預后的有力指標。

PPAT作為新的SCLC治療靶點

PPAT表達與神經內分泌癌的不良預后顯著相關引起研究人員對SCLC（小細胞肺癌）的關注，SCLC患者RNA測序結果顯示腫瘤中PPAT的表達高于正常組織，而GLS1的表達低于正常組織（圖7a）。Kaplan-Meier分析顯示腫瘤組織中PPAT高表達個體的預后明顯差于其低表達個體的預后(圖7b)。核苷酸從頭合成途徑中的限速酶磷酸核糖焦磷酸合成酶2（PRPS2）的表達也存在類似模式，其表達受c-Myc調節（圖7c）。相反，UMP合成酶（UMPS）（圖7d）、嘧啶合成限速酶和GLS1（圖7e）的表達均與SCLC患者預后無關。接下來作者用特定的shRNA將三種SCLC細胞系（MS-1-L、STC-1和SBC-3）PPAT耗竭，并研究其對3-D培養基中細胞生長的影響。結果顯示，PPAT的耗竭抑制了三種細胞系的AIG（圖7f-k），以抵抗其shRNA介導的敲除方式強制表達PPAT來逆轉SBC-3細胞的這種作用（圖7j, k）。GLS1的過表達也抑制了SBC-3細胞的AIG（圖7l-m）。綜上，PPAT表達與SCLC患者預后不良以及PPAT耗竭抑制SCLC細胞系非依賴錨定生長的強相關性表明PPAT可能是SCLC新的治療靶點。

討論

糖代謝在癌癥中被重塑，除Warburg效應的碳轉移外，氮轉移在癌癥惡性進展中也起著關鍵作用。谷氨酰胺的氮從回補途徑轉移到TCA循環再到核苷酸生物合成，這種轉移由GLS1和PPAT控制，降低PPAT/GLS1比值可以抑制多種癌癥的腫瘤生長。PPAT和GLS1都是控制來自谷氨酰胺的氮利用的決定性因素，它影響著體內外的惡性轉化效率。本研究關于細胞和小鼠及來自人類隊列的綜合薈萃分析結果表明，谷氨酰胺向核苷酸生物合成的代謝趨同可能是人類癌癥惡性進展中幾乎普遍存在的過程（圖8）。薈萃分析顯示PPAT在所有代謝酶中與惡性腫瘤相關性最強，是決定性的預后標志物，尤其在包括小細胞肺癌(SCLC)在內的神經內分泌癌中，PPAT缺失抑制SCLC生長。因此，谷氨酰胺轉運可能是惡性腫瘤進展所必需的，而調節氮代謝是SCLC治療的潛在途徑?？傊?，本研究作者明確了控制谷氨酰胺代謝命運的關鍵因素及不同器官腫瘤對這些因素的依賴，為探索不同的癌癥治療方法奠定了基礎。

參考文獻

Manabu Kodama, Masaki Matsumoto&Keiichi I. Nakayama, et al. A shift in glutamine nitrogen metabolism ontributes to the malignant progression of cancer. NATURE COMMUNICATIONS, (2020) 11:1320. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15136-9.

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