軟骨細胞衰老是骨關節炎（OA）的關鍵驅動因素，線粒體功能障礙和氧化應激可誘導軟骨細胞衰老。然而，衰老導致OA進展的具體機制尚不完全清楚。四川大學華西醫院黃澤宇和美國希望之城國家癌癥中心的郭蔚華團隊聯合在Advanced Science（IF 14.3）發表題為Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4) Exacerbates Osteoarthritis Progression in an Enzyme-Independent Manner 的文章，研究揭示了DPP4通過非酶依賴途徑加重骨關節炎疾病進展的機制，表明DPP4的非酶活性是OA治療的一個有前景的靶點。
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In vivo
基因信息
DPP4：二肽基肽酶4
病毒產品
AAV2-NC，AAV2-Dpp4-WT，AAV2-Dpp4-MUT
實驗動物
10周齡C57BL/6小鼠在DMM兩周后注射AAV
18月齡C57BL/6小鼠
注射劑量
10 μL ( 1.0× 1012 vg/mL)
注射方式
關節內注射
AAV2有效感染小鼠軟骨細胞
In vitro
病毒產品
Lv-NC，Lv-DPP4-WT，Lv-DPP4-MUT
感染組織
人和小鼠軟骨外植體
感染時間
10d
慢病毒有效感染軟骨外植體
01 研究結果
1、DPP4過表達激活氧化應激和衰老途徑
作者通過分析OA患者以及OA誘導的大鼠和小鼠軟骨樣本的RNA-seq數據，發現與OA相關的軟骨細胞中DPP4的表達升高。為了研究DPP4上調對軟骨細胞轉錄和蛋白質表達的影響，作者在C28/I2軟骨細胞中過表達DPP4，并進行了RNA-seq和4D FastDIA定量蛋白質組學分析。RNA-seq分析顯示，DPP4上調增加了與氧化應激和細胞衰老相關的基因表達，同時降低了與ECM維持、膠原合成和細胞周期轉換相關的基因的表達。在原代小鼠軟骨細胞中過表達DPP4，與對照組相比，DPP4過表達細胞衰老加劇。隨后，作者使用慢病毒在人和小鼠軟骨外植體中過表達DPP4，與對照組相比，DPP4過表達導致軟骨基質減少。此外，IF實驗表明DPP4過表達上調MMP13，P16INK4A和γH2AX ( DNA損傷標志物)，下調COL2A1。以上結果表明，DPP4過表達可能通過參與氧化應激相關和衰老相關途徑來破壞合成代謝和分解代謝之間的平衡。進一步研究發現DPP4以非酶依賴的方式破壞軟骨細胞中的線粒體動力學，從而誘導氧化應激和細胞衰老。
圖1. DPP4促進軟骨細胞氧化應激和衰老
2、軟骨細胞中DPP4的過表達加劇了DMM和衰老誘導的OA進展
為研究DPP4在OA小鼠模型中的作用，作者將含有AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT的腺相關病毒注射到小鼠膝關節腔內。通過IF分析檢測GFP的表達，證實了AAV2在軟骨細胞中的感染。在DMM和衰老誘導的OA小鼠中，與AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT組的小鼠OARSI評分更高，Dpp4表達增加。此外，DPP4的上調導致DMM和衰老誘導的小鼠出現更嚴重的滑膜炎。IHC結果顯示，AAV2-Dpp4WT和AAV2-Dpp4-MUT組的小鼠軟骨基質成分水平較低，MMP3、CTX-II和衰老相關分子水平升高，并且表現出更多的骨贅形成和軟骨下骨硬化。PAM測試發現Dpp4過表達組的小鼠疼痛耐受性較差；步態分析表明Dpp4的上調會導致小鼠運動功能障礙。以上結果表明，DPP4的上調通過非酶依賴機制加劇了DMM誘導和衰老誘導的小鼠OA。
圖2. DPP4促進DMM和衰老誘導的小鼠OA進展
3、4,5二咖啡酰奎寧酸可以緩解DMM和衰老誘導的小鼠OA
作者研究發現DPP4以非酶依賴的方式與MYH9結合，通過泛素-蛋白酶體途徑阻礙MYH9蛋白的降解，從而上調MYH9蛋白質的表達，導致線粒體功能障礙和細胞衰老。通過篩選發現4,5二咖啡酰奎寧酸可以破壞DPP4和MYH9之間的相互作用，從而促進MYH9的泛素化和降解。接下來作者探究了4,5二咖啡?？鼘幩崾欠窨梢栽隗w內緩解小鼠的OA。在衰老誘導的OA小鼠膝關節內給藥AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT。發現與PBS組相比，用4,5二咖啡?？鼘幩崽幚淼男∈蟮腛ARSI評分較低。IF檢測顯示，盡管4,5二咖啡?？鼘幩岵荒芨淖僁MM手術后軟骨細胞中DPP4的上調，但與PBS組相比，它顯著降低了MYH9的表達。IF分析顯示，與AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT仍然上調軟骨細胞中Dpp4的表達，但4,5二咖啡?？鼘幩崽幚韺е逻@兩組軟骨細胞中的MYH9沒有上調。此外4,5二咖啡?？鼘幩嵊行У馗纳屏薕A小鼠的疼痛耐受性和運動功能。以上結果支持4,5-diCQA有效緩解DMM和衰老誘導的小鼠OA的進展。
圖3. 4,5二咖啡?？鼘幩峥梢跃徑釪MM和衰老誘導的小鼠OA
02小結
本研究發現軟骨細胞中DPP4的過表達加重DMM誘導和衰老誘導的小鼠OA，DPP4抑制MYH9的泛素化和降解，而不依賴于其酶活性，導致線粒體功能障礙和細胞衰老。此外，利用4,5二咖啡酰奎寧酸降低MYH9水平可以緩解DMM和衰老誘導的小鼠OA癥狀，以上表明DPP4的非酶活性是OA治療的一個有前景的靶點。