軟骨細(xì)胞衰老是骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵驅(qū)動因素，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老。然而，衰老導(dǎo)致OA進(jìn)展的具體機制尚不完全清楚。四川大學(xué)華西醫(yī)院黃澤宇和美國希望之城國家癌癥中心的郭蔚華團(tuán)隊聯(lián)合在Advanced Science（IF 14.3）發(fā)表題為Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4) Exacerbates Osteoarthritis Progression in an Enzyme-Independent Manner 的文章，研究揭示了DPP4通過非酶依賴途徑加重骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展的機制，表明DPP4的非酶活性是OA治療的一個有前景的靶點。
· 維真助力 - AAV和Lv ·
In vivo
基因信息
DPP4：二肽基肽酶4
病毒產(chǎn)品
AAV2-NC，AAV2-Dpp4-WT，AAV2-Dpp4-MUT
實驗動物
10周齡C57BL/6小鼠在DMM兩周后注射AAV
18月齡C57BL/6小鼠
注射劑量
10 μL ( 1.0× 1012 vg/mL)
注射方式
關(guān)節(jié)內(nèi)注射
AAV2有效感染小鼠軟骨細(xì)胞
In vitro
病毒產(chǎn)品
Lv-NC，Lv-DPP4-WT，Lv-DPP4-MUT
感染組織
人和小鼠軟骨外植體
感染時間
10d
慢病毒有效感染軟骨外植體
01 研究結(jié)果
1、DPP4過表達(dá)激活氧化應(yīng)激和衰老途徑
作者通過分析OA患者以及OA誘導(dǎo)的大鼠和小鼠軟骨樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與OA相關(guān)的軟骨細(xì)胞中DPP4的表達(dá)升高。為了研究DPP4上調(diào)對軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，作者在C28/I2軟骨細(xì)胞中過表達(dá)DPP4，并進(jìn)行了RNA-seq和4D FastDIA定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。RNA-seq分析顯示，DPP4上調(diào)增加了與氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老相關(guān)的基因表達(dá)，同時降低了與ECM維持、膠原合成和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因的表達(dá)。在原代小鼠軟骨細(xì)胞中過表達(dá)DPP4，與對照組相比，DPP4過表達(dá)細(xì)胞衰老加劇。隨后，作者使用慢病毒在人和小鼠軟骨外植體中過表達(dá)DPP4，與對照組相比，DPP4過表達(dá)導(dǎo)致軟骨基質(zhì)減少。此外，IF實驗表明DPP4過表達(dá)上調(diào)MMP13，P16INK4A和γH2AX ( DNA損傷標(biāo)志物)，下調(diào)COL2A1。以上結(jié)果表明，DPP4過表達(dá)可能通過參與氧化應(yīng)激相關(guān)和衰老相關(guān)途徑來破壞合成代謝和分解代謝之間的平衡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DPP4以非酶依賴的方式破壞軟骨細(xì)胞中的線粒體動力學(xué)，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老。
圖1. DPP4促進(jìn)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和衰老
2、軟骨細(xì)胞中DPP4的過表達(dá)加劇了DMM和衰老誘導(dǎo)的OA進(jìn)展
為研究DPP4在OA小鼠模型中的作用，作者將含有AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT的腺相關(guān)病毒注射到小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。通過IF分析檢測GFP的表達(dá)，證實了AAV2在軟骨細(xì)胞中的感染。在DMM和衰老誘導(dǎo)的OA小鼠中，與AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT組的小鼠OARSI評分更高，Dpp4表達(dá)增加。此外，DPP4的上調(diào)導(dǎo)致DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的滑膜炎。IHC結(jié)果顯示，AAV2-Dpp4WT和AAV2-Dpp4-MUT組的小鼠軟骨基質(zhì)成分水平較低，MMP3、CTX-II和衰老相關(guān)分子水平升高，并且表現(xiàn)出更多的骨贅形成和軟骨下骨硬化。PAM測試發(fā)現(xiàn)Dpp4過表達(dá)組的小鼠疼痛耐受性較差；步態(tài)分析表明Dpp4的上調(diào)會導(dǎo)致小鼠運動功能障礙。以上結(jié)果表明，DPP4的上調(diào)通過非酶依賴機制加劇了DMM誘導(dǎo)和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA。
圖2. DPP4促進(jìn)DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA進(jìn)展
3、4,5二咖啡酰奎寧酸可以緩解DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA
作者研究發(fā)現(xiàn)DPP4以非酶依賴的方式與MYH9結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑阻礙MYH9蛋白的降解，從而上調(diào)MYH9蛋白質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞衰老。通過篩選發(fā)現(xiàn)4,5二咖啡酰奎寧酸可以破壞DPP4和MYH9之間的相互作用，從而促進(jìn)MYH9的泛素化和降解。接下來作者探究了4,5二咖啡酰奎寧酸是否可以在體內(nèi)緩解小鼠的OA。在衰老誘導(dǎo)的OA小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)給藥AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT。發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，用4,5二咖啡酰奎寧酸處理的小鼠的OARSI評分較低。IF檢測顯示，盡管4,5二咖啡酰奎寧酸不能改變DMM手術(shù)后軟骨細(xì)胞中DPP4的上調(diào)，但與PBS組相比，它顯著降低了MYH9的表達(dá)。IF分析顯示，與AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT仍然上調(diào)軟骨細(xì)胞中Dpp4的表達(dá)，但4,5二咖啡酰奎寧酸處理導(dǎo)致這兩組軟骨細(xì)胞中的MYH9沒有上調(diào)。此外4,5二咖啡酰奎寧酸有效地改善了OA小鼠的疼痛耐受性和運動功能。以上結(jié)果支持4,5-diCQA有效緩解DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA的進(jìn)展。
圖3. 4,5二咖啡酰奎寧酸可以緩解DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA
02小結(jié)
本研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中DPP4的過表達(dá)加重DMM誘導(dǎo)和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA，DPP4抑制MYH9的泛素化和降解，而不依賴于其酶活性，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞衰老。此外，利用4,5二咖啡酰奎寧酸降低MYH9水平可以緩解DMM和衰老誘導(dǎo)的小鼠OA癥狀，以上表明DPP4的非酶活性是OA治療的一個有前景的靶點。