??全基因組拷貝數變異（Copy Number Variation，CNV）在腫瘤的研究中占據十分重要的地位。目前，CNV已被多項研究證明參與了癌癥的發生和發展，其數量和復雜程度更是許多癌癥的預后指標。2013年9月Nature雜志發表了一篇對3299份來自于12種實體瘤樣本的研究，結論表明腫瘤可以依據驅動因素，分為M class (mutation driven，基因突變驅動) 和C class (copy number driven，拷貝數變異驅動)。其中，卵巢癌、乳腺癌、肺(鱗)癌及頭頸癌等癌癥中，CNV類型的驅動突變多于基因突變。這充分表明了CNV在腫瘤研究中的重要性。
? ? ? ??上海伯豪生物技術有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）作為上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心旗下的專業技術服務子公司，在FFPE樣品檢測服務領域有多年服務經驗，為客戶整合推出OncoScanTM FFPE檢測服務分析全面解決方案。
一． 產品介紹
? ? ? ??福爾馬林固定、石蠟包埋（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）是腫瘤醫學領域常見的樣本形式。FFPE樣本通常珍貴且保存時間長，存在樣本量稀少和高度降解的問題。因此，從FFPE?組織中獲得CNV變異信息，是一個巨大的挑戰。Affymetrix 公司的OncoScan? FFPE檢測產品針對降解狀態的FFPE樣本，開發了分子倒置探針（MIP）技術，并針對891個癌癥相關基因加密設計了探針，以提高檢測分辨率。在一個試驗中輕松完成拷貝數變異和雜合性缺失(LOH)檢測，并能檢測常見的獲得性突變。
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Affymetrix OncoScan? FFPE芯片特點
- 使用分子倒置探針(MIP)技術，針對FFPE樣本優化設計（探針結合處只需40bp的堿基）；
- 經7000多個樣本驗證，試驗成功率>90%；
- 所需起始DNA量少，陳舊FFPE樣本也有效(10年或者更久)；
- 針對約900種癌基因，能達到50-100kb拷貝數的分辨率；
- 癌基因外的全基因掃描，可達到300kb的分辨率；
- 可檢測全基因組LOH缺失，包括拷貝數中性的LOH（copy neutral LOH）；
- 檢測動態范圍可以高達10拷貝以上；
- 對關鍵癌基因如ERBB2 (Her2)、EGFR、MDM2、MYCFGFR1等，證實與FISH驗證的擴增一致。
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通過OncoScan? FFPE觀察樣本的CNV和LOH
? ? ? ??拷貝數探針強度（log2ratio）與B等位基因頻率（B-Allele Frequency, BAF）的結果是判斷樣本是否發生了CNV和LOH的直接依據。圖2展示了拷貝數增加（左圈）和減少（右圈）的示例。
? ? ? ??在圖2案例中，拷貝數增加使log2ratio大于0，且等位基因由2個等位基因增加為3個，因此BAF出現了4條帶型，帶型的頻率分布根據腫瘤樣本和正常樣本的比例決定（表2）?？截悢禍p少也會出現4個帶型，原理相似。
OncoScan? FFPE可反映樣本的亞克隆結構
? ? ? ??腫瘤樣本具有高度異質性，通過OncoScan? FFPE芯片的分析，可以觀察樣本中的亞克隆結構。圖3展示了樣本中存在2個亞克隆時的情況。2個克隆由于在組織中占比不同，因此發生缺失時log2ratio將出現2個小于0的不同數值，且BAF帶型也將呈現兩種狀態（見表2）。
二． 樣本要求
樣本準備及建議：
? ? ? ??FFPE切片（10片左右,切片厚度10um左右）
樣品量要求
- 樣品純度：RNA 應該去除干凈；
- 樣品濃度：濃度不低于12ng/μl；
- 樣品溶劑：溶解在Reduced TE（10mM Tris, pH 8,0，0.1mM EDTA）中；
- 樣品運輸： DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防污染。
三． 基礎分析內容
3.1 CNV和LOH結果統計
? ? ? ??Affymetrix Genechip Scaner產生的芯片原始數據cel文件，用CHAS(Chromosome Analysis Suite)軟件進行分析將Cel文件轉換成CYCHP文件，導出每個樣本CNV及LOH結果總表、樣本的CNV及LOH染色體分布圖和每個樣本log2Ratio、BAF總圖。
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3.2 CNV和LOH結果可視化
? ? ? ??借助CHAS軟件分染色體展示拷貝數變異和LOH。其中CNV用藍色（擴增）與紅色（缺失）表示，LOH用紫色表示。
? ? ? ??CHAS軟件也可以同時展示多個樣本的CNV或LOH結果，用于直觀比較多個樣本的相同和差異。
? ? ? ??CHAS軟件可將單個樣本的拷貝數探針(log2ratio)與SNP探針(BAF)的結果用圖形展示出來。圖8為展示結果，X軸為染色體，Y軸為log2ratio或BAF。
四． 高級分析內容
4.1多樣本CNV頻數分析
? ? ? ??在進行多個樣本分析時，可統計多個樣本的CNV頻數，直觀發現樣本之間的相似性和差異性。在下圖中，柱高代表該CNV區段在樣本中所占比例，向上為拷貝數增加，向下為拷貝數減少，不同顏色代表不同拷貝數狀態。
4.2顯著高頻CNV統計
? ? ? ??GISTIC是使用頻率較高的CNV顯著性統計軟件，可找出多個樣本（一般大于20個）中顯著高頻出現的CNV，用于推測驅動CNV變異。另外，GISTIC可根據CNV占染色體比例，將CNV區分為broad events和focal events。在對每個樣本進行分析時，GISTIC計算了各基因區域的G-score，反映了CNV的變化幅度和其在樣本之間的出現頻率。下圖展示了各樣本的G-score染色體排布，可觀察樣本之間CNV發生情況。
? ? ? ??下圖為GISTIC的主要結果，展示了擴增和缺失的顯著區域。紅色為拷貝數增加，藍色為拷貝數減少，超出閾值的區段為顯著性CNV區段。
4.3 CNV相關基因富集分析
? ? ? ??在癌癥發展中，具有驅動作用的CNV變異由于具有選擇優勢，可能會受到富集作用。因此，可對CNV中包含的基因進行GO、KEGG和疾病類型的富集分析，觀察是否有某些基因功能、通路或疾病類型被顯著富集。在下圖中，縱坐標表示Go term，橫坐標是富集因子（Rich Factor = Gene number/Total Gene Number of the term）。每個圓圈的大小與在這個Go Term上的基因成正比，顏色與根據q-value的log值從紅到綠漸變。顏色越紅，則q-value值越低，富集越顯著。
4.4 CNV聚類熱圖展示
? ? ? ??在腫瘤研究樣本數較多的情況下，可對所研究的個體進行聚類，方便對具有相似CNV發生特征的個體進行分組；也可對發生CNV的染色體區域進行聚類，尋找相似的癌癥相關基因。
? ? ? ??下圖為根據GISTIC結果，對樣本的G-score進行聚類。左上圖例：不同顏色代表不同拷貝數，折線圖表示具有該拷貝數的windows（以2Mb為單位統計）數量；右上圖例：個體表型分類；左下圖例：不同顏色代表不同染色體。
? ? ? ??也可同時對樣本和染色體區域進行聚類，如下。
? ? ? ??另外，也可根據絕對拷貝數進行聚類分析，如下圖所示。
4.5組間差異基因CNV統計
? ? ? ??在腫瘤基因組研究中，常需統計原發和轉移組，或者用藥敏感或非敏感組等之間的CNV差異。常見的統計方法如下：
（1） 尋找樣本之間共同的CNV，并以CNV區段為單位進行fisher檢驗；
（2） 以基因為單位，使用fisher檢驗統計兩組樣本中基因拷貝數變化的差異；
（3） 以GISTIC結果中基因的G-score為單位，在兩組樣本中使用t檢驗統計差異基因。
4.6基于機器學習模型篩選生物標志物
? ? ? ??SVM（Support Vector Machine，支持向量機）是一個有監督的學習模型，通常用來進行模式識別、分類以及回歸分析，能夠較好的解決小樣本的分類問題。在癌癥研究中，常需要對用藥前后，轉移和非轉移等分組進行特征性分子標志物的篩選。分類效果的好壞可以用ROC曲線（Receiver Operator Characteristic curve）對所篩選基因的準確性進行可視化展示。ROC曲線越靠近左上角，分子標志物篩選準確性就越高，當AUC值（Area Under the Curve）大于0.9時說明模型較為可靠。
