期刊：CELL

影響因子：66.85

技術服務：scRNA-seq

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導語

盡管以T細胞為中心的免疫療法已經取得了無可爭議的臨床成功，但數量有限的獲得持久響應的患者迫切需要補充的治療策略。NK細胞，作為腫瘤微環境中一類重要的組成部分參與腫瘤控制的多個過程，如直接的殺傷細胞和分泌促炎因子等。利用NK細胞進行癌癥治療已提出了大量的策略，其特點是有希望的特性，包括其安全性和有效性。特別值得注意的是，嵌合抗原受體(CAR)- NK細胞治療淋巴瘤、骨髓瘤和白血病取得了顯著的臨床成功。然而，基于NK細胞的治療在實體瘤中受到阻礙，部分原因是對腫瘤浸潤性NK細胞的了解不完全，特別是它們對腫瘤的浸潤、表型異質性和TME內的失調。

人體中的NK細胞可被劃分為2種主要的類，CD56^dimCD16^hi和CD5^6brightCD16^lo，主要基于CD56 (NCAM1) 和 CD16 (FCGR3A)的表達水平。CD56^dimCD16^hi?NK細胞群主要通過分泌穿孔素和顆粒酶介導靶細胞的殺傷，而CD56^brightCD16^lo?NK細胞群表現出免疫調節和細胞因子產生能力。近期，單細胞RNA測序技術促進了腫瘤浸潤免疫細胞異質性的表征，為闡明腫瘤浸潤NK細胞亞群的圖譜提供了很大機會。例如，我們鑒定了CD160⁺HSPA1A⁺肝常駐細胞亞型在肝細胞癌中的特異性富集，其他人則報道了出現在黑色素瘤中浸潤的特異的NK細胞亞群具有區域性差異。同時，人類NK細胞在在健康組織和血液中的分布和功能也得到了研究。然而，對于腫瘤浸潤的NK細胞，大多數單細胞RNA測序的規模是有限的，并且它們在惡性疾病中獲得的異質性表型的程度仍不清楚。

與CD8⁺?T細胞相比，NK細胞作為細胞毒性活性的替代來源，以低突變負荷和主要組織相容性復合體(MHC) I類異常表達來對抗腫瘤細胞。盡管CD8^+?T細胞的功能失調狀態以細胞毒性降低和多種抑制受體的高表達為特征，但NK細胞功能失調尚未得到詳細研究。此前，肝癌中有NK細胞功能低下的報道，但尚未分析其免疫調節機制，其他癌癥類型是否也存在這種現象尚不清楚。此外，盡管TIGIT和TIM3在腫瘤浸潤性NK細胞中的抑制作用已經明確，但其他免疫檢查點如PD-1和CTLA4是否在這些細胞中發揮同樣的作用甚至表達仍然存在爭議。此外，NK細胞對TME的免疫抑制因子敏感，這可能導致它們的功能失調的表型，但不同的調節過程如何影響不同癌癥類型的TME中NK細胞的功能和豐度尚不清楚。總之，這些促使我們對NK細胞進行深入研究，以闡明它們在泛癌癥水平上的異質性和功能障礙。

在這里，我們收集了廣泛的已發表和新生成的scRNA-seq數據，構建了一個全面的腫瘤浸潤人類NK細胞圖譜，并探索了NK細胞在不同癌癥類型和組織中的異質性。我們揭示了腫瘤浸潤NK細胞狀態的轉變，并強調了可能導致NK細胞功能障礙的TME成分。這些數據將為促進對主要癌癥類型中NK細胞的整體特性的理解提供豐富的資源，并為基于NK細胞的免疫治療的發展提供有價值的見解。

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技術服務

scRNA-seq

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研究結果

1. 在單細胞分辨率水平下構建人類泛癌NK細胞圖譜

為腫瘤浸潤NK細胞構建一個綜合的泛癌單細胞轉錄組圖譜，我們首先從我們新生成的數據集中收集了47名診斷為8種癌癥類型之一的患者的scRNA-seq數據和70個其他已發表的數據集。這些數據覆蓋了24種癌癥類型，包括來自716個病人的1223個樣本，包括腫瘤、臨近非腫瘤組織、外周血、和其他組織如淋巴結，以及60名健康對照樣本(圖1A-B)。經過嚴格的質控和計算門控(CD3CD56⁺/KLRF1⁺)及非監督聚類結合的方法，本研究中我們獲得了160011個高質量的NK細胞，包含11963個新生成的NK細胞。值得注意的是，考慮到腫瘤組織內NK細胞在CD45⁺細胞中相對較少，對它們的異質性了解的較少，因此，構建如此大規模的NK細胞圖譜是必不可少且有挑戰性的。與先前的來自人血液和脾臟的7000個NK細胞構建的NK細胞單細胞轉錄組圖譜相比，我們的規模擴大了20倍，代表了大多數主要的癌癥類型和多種組織。

為了無偏的定義NK細胞的泛癌群體結構，我們整合了數據集之間最小批次效應的單細胞RNA數據，并進行了2輪無監督聚類。第一輪分析涉及區分兩種特征明確的主要細胞類型，CD56^brightCD16^lo?和 CD56^dimCD16^hi，主要基于高表達的典型細胞標記NCAM1和FCGR3A，分別對應于先前報道的“NK_1”和“NK_2”群體。CD56^brightCD16^lo區可以進一步細分為5個子集，而CD56^dimCD16^hi區在第二輪聚類中被識別出9個子集(圖1C-D)。我們沒有觀察到兩種主要大群在不同癌癥類型或不同亞群中KLRF1的表達有顯著差異. 值得注意的是，之前報道的ILC細胞標記基因幾乎不在這些NK細胞亞群中表達，表明了我們數據的純度。這些亞群的特點是在每個主要群體中都有不同的特征基因的高表達。正如預期的那樣，先前描述的亞群很容易在我們的圖譜中被識別出來，例如CD56^brightCD16^lo?c5-CREM亞群伴隨著CREM高表達。伴隨著KLRC2 (NKG2C)的高表達的CD56^dimCD16^hi?c8-KLRC2 NK 細胞亞群被視為適應性的NK細胞。我們的圖譜還發現了幾個被低估的NK細胞亞群，它們具有獨特的轉錄表型。例如，CD56^dimCD16^hi?c5-MKI67以MKI67和STMN1等增殖標志物的高表達為特征，CD56^dimCD16^hi?c6-DNAJB1特異性表達與應激反應相關的基因。我們的圖譜還在幾乎所有癌癥類型中捕獲了低比例的CD56^brightCD16^hi?NK細胞，同時表達高水平的NCAM1和FCGR3A。CD56^brightCD16^hi?NK細胞表現出介于CD56^brightCD16^lo和CD56^dimCD16^hi?NK細胞之間的中間特征，可能代表了類似于小鼠CD27⁺CD11b^+?NK細胞的發育中間體，這也被認為是小鼠的短暫成熟階段，但scRNA-seq幾乎無法檢測到。接下來，我們檢查了所有亞群的組織分布，觀察到不同的組織富集模式，表明我們的綜合分析可以保留不同組織的異質性 (圖1E-F)。為了進一步證實聚類的穩定性，我們將血液、腫瘤和鄰近非腫瘤組織中的NK細胞分別重新聚類，結果顯示高度一致。最后，利用可以測量細胞簇純度的全局未移位熵比(ROGUE)指數，表明所有這些群體在各種癌癥類型中都是穩健的。

NK細胞亞群參與了不同的發育階段，其共同譜系特異性基因的表達揭示了這一點。腫瘤中富集的CD56^bright?CD16^lo?c4-IL-7R和血液中富集的c2-IL-7R-RGS1^lo細胞，高表達NK細胞前體標志物，都是在發育早期繪制的。相比之下，其他未成熟的CD56^brightCD16^lo亞群表現出前體標志物的逐漸減少和CD160表達的大量增加。更成熟的CD56^dimCD16^hi亞群，特別是c6-DNAJB1和c7- NR4A3，除了FCGR3A和B3GAT1 (CD57)外，還表現出殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)家族的上調。不同發育狀態的NK細胞亞群在腫瘤中同時存在，表明NK細胞向腫瘤的遷移可能與NK細胞成熟解耦有關。

我們進一步檢查了基因表達特征，以破譯不同群體之間的功能差異(圖1G)。CD56^dimCD16^hi?NK細胞高表達細胞毒效應基因，包括穿孔素(PRF1)和除GZMK外的大多數顆粒酶(GZMB、GZMA和GZMH)，而GZMK只在CD56^brightCD16^lo?NK細胞中表達。CD56^brightCD16^lo?NK細胞表達多種細胞因子基因，如IL18。我們還觀察到CD56^brightCD16^lo?c2和c4同時表達il -18及其受體IL18R1，這意味著il -18依賴性自分泌途徑在這些亞群中可能起著至關重要的作用。引人注目的是，CD56^dimCD16^hi?NK細胞亞群也可以表現出某些細胞因子的特異性表達，但與CD56^brightCD16^lo亞群具有不同的模式。特別是，CD56^dim?CD16^hi亞群c4-NFKBIA在所有NK細胞亞群中表現出相對較高的炎癥評分，主要表達CCL3、CCL4和CCL4L2，表明它們有能力招募其他免疫細胞，如T細胞。最近的研究將1型常規樹突狀細胞(cDC1s)募集到腫瘤與NK細胞聯系起來，通過NK細胞分泌XCL1、XCL2和CCL5來實現。我們的研究鑒定出了通過細胞類型特異性互補策略參與cDC1募集的多種NK細胞亞群。CD56^brightCD16^lo?c2和c4表達初級水平的XCL1和XCL2，而CD56^brightCD16^lo?(c1-GZMH和c3-CCL3)和CD56^dimCD16^hi?(c1-IL-32和c8-KLRC2) NK細胞優先表達另一個cDC1趨化基因CCL5。此外，我們描述了激活和抑制受體的概況，觀察到NK細胞亞群的明顯變化。例如，KLRC1在CD56^brightCD16^lo?NK細胞中的表達水平高于CD56^dimCD16^hi?NK細胞，盡管不是特異性的，LAG3和TIGIT在c8-KLRC2中高表達。值得注意的是，與其他組織富集的CD56^dimCD16^hi亞群(c4-NFKBIA, c5-MKI67和c7-NR4A3)相比，c6-DNAJB1 NK細胞表現出最高的應激評分和最弱的細胞毒性，表明它們的轉錄和功能表型存在顯著差異(圖1G)。綜上所述，我們以細粒度的亞群分辨率提供了NK細胞的詳細轉錄組譜。而不是分析NK細胞作為一個單一的群體，我們剖析NK細胞的亞群特異性分子特性，并揭示其未被重視的異質性。

圖1

2. 不同腫瘤類型NK細胞的組織異質性

接下來，我們評估了腫瘤浸潤NK細胞群在不同癌癥類型中的偏好，觀察到明顯的差異(Figure 2A)。例如，未成熟的CD56^brightCD16^lo?NK細胞在鼻咽癌和基底細胞癌中占主導地位，而成熟的CD56^dimCD16^hi?NK細胞在腎癌和肺癌中占主導地位，這與先前的報道一致。其他的，如結直腸癌和肝癌，沒有明顯的傾向(圖2A)。為了檢驗上述趨勢是否可以用器官結構來解釋，我們分析了鄰近非腫瘤組織中主要NK細胞類型的內在組成及其在腫瘤中的相應變化。在某些類型的癌癥中，如結直腸癌，腫瘤組織的NK細胞組成與鄰近的非腫瘤組織相似。在肺癌、腎癌等腫瘤類型中，盡管腫瘤與鄰近非腫瘤組織中主要NK細胞類型保持不變，但CD56^dimCD16^hi?NK細胞的比例明顯降低(圖2B)。有趣的是，乳腺癌和食管癌腫瘤主要的NK細胞群與它們的鄰近非腫瘤組織相比是相反的(圖2C)。這些觀察結果表明，內部器官特性和惡性腫瘤相關因素對形成NK細胞群的成分有復合的影響。

我們進一步從子集的角度探索NK細胞的癌癥類型特異性，并進行無監督聚類，根據NK細胞亞群比例對所分析的癌癥類型進行分層。NK細胞亞群如c2-CX3CR1在胰腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中表現出強烈的偏好。在某些亞型的癌癥類型中觀察到高變異性。例如c4-NFKBIA和c7-NR4A3從頭頸部鱗狀細胞癌和甲狀腺癌到食管癌和鼻咽癌的中位數頻率顯著降低(圖2D)。盡管觀察到明顯的差異，但包括子宮內膜癌、基底細胞癌和食管癌在內的癌癥類型聚集在一起，均具有豐富的CD56^brightCD16^hi?c5-CREM和較少的c4-IL-7R NK細胞。特別值得注意的是，具有上述低飽和度階段的罕見CD56^brightCD16^hi?NK細胞亞群在黑色素瘤和白血病中大量存在，特別是在急性髓系白血病(AML)亞型中(圖2D)。NK細胞的這種低飽和度階段與AML患者的總生存期和無復發生存期的降低有關。與其他NK細胞群相比，這些CD56^brightCD16^hi細胞在其極低的激活和抑制受體評分方面表現出獨特的表型和功能變化(圖2E)。目前基于NK細胞的治療側重于增強NK細胞的激活和壽命，但通常忽略了癌癥類型之間的異質性和TME對NK細胞細胞毒性功能的抑制作用，這些都應該在未來的治療策略中加以考慮。

圖2

3. RGS1是組織浸潤NK細胞的標志

如上所述，NK細胞成分從血液到組織都發生了顯著變化。同樣，在組織浸潤NK細胞和它們的血液對應物之間檢測到廣泛的轉錄變化(圖3A-B)。先前的研究已經確定了組織駐留NK細胞的幾種標記物，如CD69、CD103、CXCR6和CD49a。然而，我們發現ITGA1 (CD49a)、ITGAE (CD103)和CXCR6在單細胞轉錄組水平很少被檢測到，CD69在NK細胞中廣泛表達，包括血液來源的(圖3E)。此外，有報道顯示，這些標記物在特定組織的NK細胞群中優先表達。這些促使我們以無偏的方式從泛癌的角度發現強大的NK細胞駐留標記。

我們選擇了血液和組織之間的差異表達基因，并進一步評估了它們的敏感性和特異性，以區分NK細胞的組織來源。因此，RGS1 (G蛋白信號1的調節因子)被明確識別，它只在腫瘤和鄰近非腫瘤組織的NK細胞中表達，而在血液中幾乎檢測不到(圖3C-D)。此外，RGS1的表達與KLF2、SELL等遷移信號相反(圖3E)。與上述常規組織駐留標記相比，RGS1具有更高的敏感性和特異性。接下來，我們直接比較了RGS1與ITGAE、CD69及其聯合在血液中的表達模式，發現RGS1單獨在血液中的檢出率最低，而RGS1/CD69聯合可以進一步提高組織中的陽性檢出率(圖3F)。此外，RGS1/CD69聯合在區分血液和非血液NK細胞方面比單獨使用具有更高的曲線下面積(AUC)值。值得注意的是，RGS1在分析的患者和癌癥類型中廣泛表達(圖3G-H)。

綜上所述，這些特征暗示了RGS1單獨或與CD69結合的潛在作用，在轉錄組水平上是組織浸潤NK細胞的優良標記物。我們推測RGS1的表達可能減弱G蛋白的信號活性，導致NK細胞趨化遷移能力減弱，促進NK細胞駐留。RGS1在NK細胞中的作用機制有待進一步研究。

圖3

4. 腫瘤相關NK細胞程序及其特征

接下來，我們試圖闡明NK細胞在腫瘤中的明確特征。除了上述某些亞群在腫瘤特異性富集外，我們發現，與鄰近的非腫瘤組織相比，在腫瘤中，CD56^brightCD16^lo?c3-CCL3 NK細胞的細胞因子產量較低，表現為CCL3和CCL4的表達減少，并且在大多數癌癥類型中，c5-CREM NK細胞中XCL1和XCL2的表達減少，暗示它們在腫瘤中的功能轉換。然后，我們使用SCENIC識別了腫瘤浸潤性CD56^brightCD16^lo和CD56^dim?CD16^hi?NK細胞亞群的激活調控子。重要的是，腫瘤富集的c6-DNAJB1亞群表現出更高的轉錄因子如KLF6和EGR3的表達，這些轉錄因子與細胞毒性功能的抑制有關。

利用RNA速率，我們解碼了NK細胞的轉錄動力學，在CD56^brightCD16^lo和CD56^dimCD16^hi?NK細胞中觀察到從血液富集的亞群到腫瘤浸潤群的明確定向流動(圖4A)。相應的，RGS1的表達沿流速方向升高。我們發現CD56^dimCD16^hi?c6-DNAJB1 NK細胞位于速率末端，從而推斷為終末狀態(圖4A)。值得注意的是，來自鄰近非腫瘤組織的CD56^dimCD16^hi?NK細胞主要觀察到在UMPA圖上富含c7-NR4A3細胞; 相比之下，腫瘤來源的CD56^dimCD16^hi?NK細胞在富含c6-DNAJB1細胞的UMAP圖上占優勢地位(圖4B)。與此一致的是，腫瘤富集的c6- DNAJB1 NK細胞的標記物，如DNAJB1和HSPA1A在腫瘤浸潤的CD56^dimCD16^hi?NK細胞群中高度表達(圖4C)。此外，我們觀察到c6-DNAJB1和c7-NR4A3 NK細胞中線粒體基因的表達水平相似，表明c6-DNAJB1 NK細胞的應激表型與細胞質量無關。由于c6-DNAJB1細胞在腫瘤中特異性富集，我們將這一群體稱為腫瘤相關NK (TaNK)細胞。

多重免疫熒光染色進一步證實了腫瘤中TaNK細胞的存在(圖4D)。我們還利用流式細胞術驗證了TaNK細胞(CD56^dimCD16^hi?HSP40+)在體內腫瘤的富集。在1例肝內膽管癌和6例HCC樣本中，我們發現了TaNK細胞，它們在腫瘤浸潤性CD56^dimCD16^hi?NK細胞中的比例高于對應的鄰近肝組織，這與我們的scRNA-seq數據一致(圖4E)。

然后，我們使用擬時序推斷分析來研究CD56^dimCD16^hi?NK細胞的動態，發現TaNK細胞在CD56^dimCD16^hi?NK細胞的推斷擬時間內越來越多地出現，并且在終末期富集，與RNA速率分析的結果一致。為了檢驗TaNK細胞的新特征，我們將基因表達譜與擬時間擬合。有趣的是，CD56^dimCD16^hi?NK細胞在過渡過程中表現出細胞毒性降低，抑制受體和應激基因表達升高(圖4F)。

值得注意的是，在所有腫瘤浸潤的CD56^dimCD16^hi?NK細胞亞群中，末端TaNK細胞具有最低的細胞毒性和最高的應激評分。相比之下，相應的c7- NR4A3在鄰近的非腫瘤組織中富集，具有高度的細胞毒性(圖 4G)。通過對幾種癌癥類型進行多重免疫熒光染色，我們觀察到TaNK細胞表現出較低水平的GZMB (圖4H)。肝癌患者流式細胞術分析進一步證實，與CD56^dimCD16^hi?HSP40⁺?NK細胞相比，TaNK細胞腫瘤部位細胞毒性顆粒(顆粒酶B和穿孔素)表達較低，抑制受體CD158a (KIR2DL1)和CD158e (KIR3DL1)表達較高(圖4I -J)。這些結果表明，TaNK細胞可能與功能失調狀態有關。此外，我們還觀察到NR4A核受體家族隨著擬時間順序的增加而呈現的動態差異趨勢(圖4F)。c7-NR4A3 NK細胞高表達NR4A2和NR4A3，而TaNK細胞高表達NR4A1。有趣的是，NR4A1已被確定為T細胞功能障礙的關鍵介質，并被認為有助于限制實體瘤中CAR - T細胞的功能?？傊覀兊臄祿砻?，腫瘤中的TaNK細胞可能最終功能失調，并可能在TME中發揮關鍵作用。

圖4

5. TaNK細胞與不良預后和免疫治療耐藥的關系

由于NK細胞和CD8⁺?T細胞表現出廣泛的表型和功能相似性，我們接下來研究了靶向CD8⁺?T細胞的免疫檢查點阻斷(ICB)療法是否也會影響NK細胞。在腫瘤浸潤性NK細胞和CD8^+?T細胞中，TaNK細胞和耗竭T細胞(Tex)表現出明顯的應激狀態(圖5A)，提示它們參與腫瘤免疫應答。均高度表達一系列抑制受體分子;然而，它們在各種免疫調節基因上具有不同的表達譜。傳統的免疫檢查點基因如PDCD1和CTLA4在TaNK細胞上幾乎不表達(圖5A)，這意味著它們不是抗PD -1/CTLA-4治療的直接靶點。因此，在TME和當前的ICB治療中，TaNK細胞可能與Tex細胞發揮不同的作用。

我們觀察到不同癌癥類型的TaNK細胞豐度存在顯著差異(圖5B)，腫瘤時期對TaNK細胞比例的影響很小(圖5C)。值得注意的是，在癌癥基因組圖譜(TCGA)數據集中，腫瘤中的高TaNK細胞信號與大多數癌癥類型的低生存率相關(圖5D-E)。我們進一步應用基于深度學習的模型進行反卷積和細胞組成分析，發現高TaNK細胞頻率表明癌癥患者預后不良。此外，我們通過分析先前乳腺癌和黑色素瘤的ICB治療研究中預處理腫瘤的scRNA-seq數據，進一步研究了TaNK細胞是否與ICB治療應答相關(圖5F)。引人注目的是，在兩種癌癥類型中，無應答患者中觀察到的TaNK細胞比例高于應答患者。進一步利用來自各種癌癥(包括黑色素瘤、肺癌、轉移性尿路上皮癌)的已發表的大量數據，我們驗證了無應答患者比應答患者表現出更強的TaNK細胞信號(圖5G)。

我們推測，長期浸潤可能賦予腫瘤中TaNK細胞的功能狀態，導致其對惡性細胞的無效殺傷。TaNK細胞的富集與對抗腫瘤的免疫反應受損以及對當前ICB治療的低敏感性有關。我們的發現揭示了TaNK細胞在腫瘤中的潛在作用，并為NK細胞免疫療法的合理設計提供了參考。

圖5

6. TME中塑造腫瘤浸潤NK細胞功能的潛在介質

為了深入了解NK細胞在TME中的調控程序，我們利用CellPhoneDB來探測NK細胞和其他CD45⁺免疫細胞(包括T細胞和髓系細胞)之間潛在的細胞-細胞相互作用。與T細胞相比，除肥大細胞外，大多數髓系細胞類型與CD56^dimCD16^hi?NK亞群表現出強烈的潛在相互作用(圖6A)。特別有趣的是，TaNK細胞被預測通過ANXA1調節多種髓系細胞類型，ANXA1是一種在炎癥反應中與免疫抑制和誘導巨噬細胞重編程相關的蛋白質(圖6B)。這表明功能失調的NK細胞可能具有抑制TME中促炎巨噬細胞的潛力。為了進一步闡明NK細胞來源的ANXA1在巨噬細胞中的作用，我們對肺癌和肝癌的腫瘤樣本進行了多重免疫熒光染色，發現了一個ANXA1⁺?NK細胞群。與遠離ANXA1⁺?NK細胞的巨噬細胞相比，靠近ANXA1⁺?NK細胞的巨噬細胞表現出較低的活化標志物CD86(圖6C-D)和較高的抗炎標志物轉化生長因子b (TGF-b)的表達水平(圖6E-F)。

值得注意的是，在樹突狀細胞(DC)亞群中，LAMP3⁺?DC，最近表征的成熟cDCs(也稱為mregDC)顯示出與CD56^dimCD16^hi?NK細胞最強的相互作用潛力(圖6A)。多重免疫熒光分析顯示，LAMP3⁺?DCs與NK細胞共定位(圖6J)。此外，預測它們之間的相互作用通過IL-15-IL-15受體和NECTIN2-TIGIT相互作用軸介導(圖6B)。重要的是，LAMP3⁺?DC在轉錄組水平上表達免疫群體中最高水平的IL15、PVRL2 (NECTIN2)和PVR(圖6G)。流式細胞術也證實了IL-15在LAMP3^+?DC中的高表達(圖6H)。IL-15已被確定為維持NK細胞壽命的穩態相關細胞因子，并用于NK細胞輸注和體外繁殖。相比之下，TIGIT作為抑制受體有助于抑制NK細胞介導的免疫反應。此外，在TCGA數據集中，LAMP3⁺?DC的豐度與CD56^dimCD16^hi?NK細胞相關(圖6I)。接下來，我們研究了LAMP3^+?DC在腫瘤中的具體調控過程，發現腫瘤浸潤的LAMP3⁺DC與鄰近非腫瘤組織相比，IL15的表達較低(圖S6K)，這表明LAMP3⁺?DC可能對TME中CD56^dimCD16^hi?NK細胞的激活作用受損。事實上，物理上接近LAMP3⁺?DC的NK細胞表達顆粒酶B的水平較低(圖6J-K)?？傊?，我們的分析表明，在TME中，LAMP3⁺?DC對CD56^dimCD16^hi?NK細胞的異常調節。

圖6

7. 外周血NK細胞亞群的不同轉錄組模式

NK細胞在血液中的淋巴細胞室中占相當大的比例，但它們在腫瘤誘導的外周免疫系統中的作用相對不明確。我們的圖譜包含來自35名健康供者的血液來源NK細胞的9個scRNA數據集，使我們能夠探測腫瘤患者外周血中NK細胞的特異性改變。

我們首先比較了來自健康供者的循環NK細胞與來自腫瘤患者的循環NK細胞的轉錄組特征，不同數據集的健康供者的循環NK細胞顯示出高度相似性(圖7B)。相比之下，對于來自腫瘤患者的循環CD56^brightCD16^lo細胞，我們觀察到與健康供者的轉錄組存在顯著差異;在所分析的所有癌癥類型中，循環CD56^dimCD16^hi細胞的差異甚至更為顯著(圖7A)。值得注意的是，腫瘤患者在NK細胞亞群中表現出顯著的組成變化，這種模式似乎是癌癥類型特異性的(圖7C)。例如，在結直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎癌和HCC中，循環CD56^brightCD16^lo?c3-CCL3 NK細胞的比例增加，但在其他被分析的癌癥類型中沒有增加。

接下來，我們將重點放在CD56^dimCD16^hi?c8-KLRC2適應性NK細胞上，該細胞在某些癌癥類型如結直腸癌和胃癌中富集(圖7D)。適應性NK細胞被認為是CAR NK細胞的一個有吸引力的來源，因為它們具有增強細胞因子反應的效應特性和對免疫抑制效應的內在抗性。特別有趣的是，根據我們的數據，與其他循環NK細胞相比，這些細胞特異性表達MHC II類基因(圖7E)。我們還檢查了這些NK細胞在腫瘤患者中的功能變化，發現與健康供體相比，患者來源的適應性NK細胞的功能基因和MHC II類基因的表達明顯更高(圖7F, 7H)，這意味著它們在腫瘤患者中處于高度激活狀態。我們通過流式細胞術進一步證實，與健康供者相比，HCC患者循環NK細胞中MHC II類分子的高表達(圖7G)。因此，在患者源性適應性NK細胞中上調的基因參與了免疫效應過程的正調控等途徑(圖7I)。綜上所述，我們的分析表明，循環NK細胞參與了腫瘤進展過程中外周免疫環境的系統性變化。

圖7

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結論

NK細胞在對抗腫瘤進展的先天免疫應答中起著不可或缺的作用。為了描述他們在腫瘤微環境中的表型和功能多樣性，我們對716名癌癥患者的NK細胞做了綜合的單細胞RNA測序分析，涵蓋了24種癌癥類型。我們在腫瘤類型特異的種類中觀察到NK細胞組成的異質性。值得注意的是，我們鑒定出了一組腫瘤相關的NK細胞，他們在腫瘤中富集，顯示出抗腫瘤功能受損，并與不良預后及免疫治療耐受有關。特定的髓系細胞亞群，特別是LAMP3⁺DC細胞，可能介導NK細胞抗腫瘤免疫的調節?？傊?，我們的綜合分析增強了目前從泛癌癥角度對NK細胞的理解，闡明了NK細胞群體結構以及腫瘤誘導的局部和全身NK細胞反應的見解。為了方便廣泛的研究社區使用我們的數據，已經開發了一個交互式門戶網站(http://pan-nk.cancer-pku.cn/)來分析和可視化我們的單細胞數據。我們設想我們的大規模數據可以進一步促進NK細胞免疫療法在更多癌癥患者中的應用。

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參考文獻：

Tang F, Li J, Qi L, Liu D, Bo Y, Qin S, Miao Y, Yu K, Hou W, Li J, Peng J, Tian Z, Zhu L, Peng H, Wang D, Zhang Z. 2023. A pan-cancer single-cell panorama of human natural killer cells. Cell, 186(19):4235-4251. doi: 10.1016/j.cell.2023.07.034.