期刊：CELL
影響因子：66.85
技術(shù)服務(wù)：scRNA-seq
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導(dǎo)語
盡管以T細胞為中心的免疫療法已經(jīng)取得了無可爭議的臨床成功，但數(shù)量有限的獲得持久響應(yīng)的患者迫切需要補充的治療策略。NK細胞，作為腫瘤微環(huán)境中一類重要的組成部分參與腫瘤控制的多個過程，如直接的殺傷細胞和分泌促炎因子等。利用NK細胞進行癌癥治療已提出了大量的策略，其特點是有希望的特性，包括其安全性和有效性。特別值得注意的是，嵌合抗原受體(CAR)- NK細胞治療淋巴瘤、骨髓瘤和白血病取得了顯著的臨床成功。然而，基于NK細胞的治療在實體瘤中受到阻礙，部分原因是對腫瘤浸潤性NK細胞的了解不完全，特別是它們對腫瘤的浸潤、表型異質(zhì)性和TME內(nèi)的失調(diào)。
人體中的NK細胞可被劃分為2種主要的類，CD56dimCD16hi和CD56brightCD16lo，主要基于CD56 (NCAM1) 和 CD16 (FCGR3A)的表達水平。CD56dimCD16hi?NK細胞群主要通過分泌穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)靶細胞的殺傷，而CD56brightCD16lo?NK細胞群表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)和細胞因子產(chǎn)生能力。近期，單細胞RNA測序技術(shù)促進了腫瘤浸潤免疫細胞異質(zhì)性的表征，為闡明腫瘤浸潤NK細胞亞群的圖譜提供了很大機會。例如，我們鑒定了CD160+HSPA1A+肝常駐細胞亞型在肝細胞癌中的特異性富集，其他人則報道了出現(xiàn)在黑色素瘤中浸潤的特異的NK細胞亞群具有區(qū)域性差異。同時，人類NK細胞在在健康組織和血液中的分布和功能也得到了研究。然而，對于腫瘤浸潤的NK細胞，大多數(shù)單細胞RNA測序的規(guī)模是有限的，并且它們在惡性疾病中獲得的異質(zhì)性表型的程度仍不清楚。
與CD8+?T細胞相比，NK細胞作為細胞毒性活性的替代來源，以低突變負荷和主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類異常表達來對抗腫瘤細胞。盡管CD8+?T細胞的功能失調(diào)狀態(tài)以細胞毒性降低和多種抑制受體的高表達為特征，但NK細胞功能失調(diào)尚未得到詳細研究。此前，肝癌中有NK細胞功能低下的報道，但尚未分析其免疫調(diào)節(jié)機制，其他癌癥類型是否也存在這種現(xiàn)象尚不清楚。此外，盡管TIGIT和TIM3在腫瘤浸潤性NK細胞中的抑制作用已經(jīng)明確，但其他免疫檢查點如PD-1和CTLA4是否在這些細胞中發(fā)揮同樣的作用甚至表達仍然存在爭議。此外，NK細胞對TME的免疫抑制因子敏感，這可能導(dǎo)致它們的功能失調(diào)的表型，但不同的調(diào)節(jié)過程如何影響不同癌癥類型的TME中NK細胞的功能和豐度尚不清楚?？傊?，這些促使我們對NK細胞進行深入研究，以闡明它們在泛癌癥水平上的異質(zhì)性和功能障礙。
在這里，我們收集了廣泛的已發(fā)表和新生成的scRNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個全面的腫瘤浸潤人類NK細胞圖譜，并探索了NK細胞在不同癌癥類型和組織中的異質(zhì)性。我們揭示了腫瘤浸潤NK細胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，并強調(diào)了可能導(dǎo)致NK細胞功能障礙的TME成分。這些數(shù)據(jù)將為促進對主要癌癥類型中NK細胞的整體特性的理解提供豐富的資源，并為基于NK細胞的免疫治療的發(fā)展提供有價值的見解。
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技術(shù)服務(wù)
scRNA-seq
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研究結(jié)果
1. 在單細胞分辨率水平下構(gòu)建人類泛癌NK細胞圖譜
為腫瘤浸潤NK細胞構(gòu)建一個綜合的泛癌單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，我們首先從我們新生成的數(shù)據(jù)集中收集了47名診斷為8種癌癥類型之一的患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)和70個其他已發(fā)表的數(shù)據(jù)集。這些數(shù)據(jù)覆蓋了24種癌癥類型，包括來自716個病人的1223個樣本，包括腫瘤、臨近非腫瘤組織、外周血、和其他組織如淋巴結(jié)，以及60名健康對照樣本(圖1A-B)。經(jīng)過嚴格的質(zhì)控和計算門控(CD3CD56+/KLRF1+)及非監(jiān)督聚類結(jié)合的方法，本研究中我們獲得了160011個高質(zhì)量的NK細胞，包含11963個新生成的NK細胞。值得注意的是，考慮到腫瘤組織內(nèi)NK細胞在CD45+細胞中相對較少，對它們的異質(zhì)性了解的較少，因此，構(gòu)建如此大規(guī)模的NK細胞圖譜是必不可少且有挑戰(zhàn)性的。與先前的來自人血液和脾臟的7000個NK細胞構(gòu)建的NK細胞單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜相比，我們的規(guī)模擴大了20倍，代表了大多數(shù)主要的癌癥類型和多種組織。
為了無偏的定義NK細胞的泛癌群體結(jié)構(gòu)，我們整合了數(shù)據(jù)集之間最小批次效應(yīng)的單細胞RNA數(shù)據(jù)，并進行了2輪無監(jiān)督聚類。第一輪分析涉及區(qū)分兩種特征明確的主要細胞類型，CD56brightCD16lo?和 CD56dimCD16hi，主要基于高表達的典型細胞標記NCAM1和FCGR3A，分別對應(yīng)于先前報道的“NK_1”和“NK_2”群體。CD56brightCD16lo區(qū)可以進一步細分為5個子集，而CD56dimCD16hi區(qū)在第二輪聚類中被識別出9個子集(圖1C-D)。我們沒有觀察到兩種主要大群在不同癌癥類型或不同亞群中KLRF1的表達有顯著差異. 值得注意的是，之前報道的ILC細胞標記基因幾乎不在這些NK細胞亞群中表達，表明了我們數(shù)據(jù)的純度。這些亞群的特點是在每個主要群體中都有不同的特征基因的高表達。正如預(yù)期的那樣，先前描述的亞群很容易在我們的圖譜中被識別出來，例如CD56brightCD16lo?c5-CREM亞群伴隨著CREM高表達。伴隨著KLRC2 (NKG2C)的高表達的CD56dimCD16hi?c8-KLRC2 NK 細胞亞群被視為適應(yīng)性的NK細胞。我們的圖譜還發(fā)現(xiàn)了幾個被低估的NK細胞亞群，它們具有獨特的轉(zhuǎn)錄表型。例如，CD56dimCD16hi?c5-MKI67以MKI67和STMN1等增殖標志物的高表達為特征，CD56dimCD16hi?c6-DNAJB1特異性表達與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因。我們的圖譜還在幾乎所有癌癥類型中捕獲了低比例的CD56brightCD16hi?NK細胞，同時表達高水平的NCAM1和FCGR3A。CD56brightCD16hi?NK細胞表現(xiàn)出介于CD56brightCD16lo和CD56dimCD16hi?NK細胞之間的中間特征，可能代表了類似于小鼠CD27+CD11b+?NK細胞的發(fā)育中間體，這也被認為是小鼠的短暫成熟階段，但scRNA-seq幾乎無法檢測到。接下來，我們檢查了所有亞群的組織分布，觀察到不同的組織富集模式，表明我們的綜合分析可以保留不同組織的異質(zhì)性 (圖1E-F)。為了進一步證實聚類的穩(wěn)定性，我們將血液、腫瘤和鄰近非腫瘤組織中的NK細胞分別重新聚類，結(jié)果顯示高度一致。最后，利用可以測量細胞簇純度的全局未移位熵比(ROGUE)指數(shù)，表明所有這些群體在各種癌癥類型中都是穩(wěn)健的。
NK細胞亞群參與了不同的發(fā)育階段，其共同譜系特異性基因的表達揭示了這一點。腫瘤中富集的CD56bright?CD16lo?c4-IL-7R和血液中富集的c2-IL-7R-RGS1lo細胞，高表達NK細胞前體標志物，都是在發(fā)育早期繪制的。相比之下，其他未成熟的CD56brightCD16lo亞群表現(xiàn)出前體標志物的逐漸減少和CD160表達的大量增加。更成熟的CD56dimCD16hi亞群，特別是c6-DNAJB1和c7- NR4A3，除了FCGR3A和B3GAT1 (CD57)外，還表現(xiàn)出殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)家族的上調(diào)。不同發(fā)育狀態(tài)的NK細胞亞群在腫瘤中同時存在，表明NK細胞向腫瘤的遷移可能與NK細胞成熟解耦有關(guān)。
我們進一步檢查了基因表達特征，以破譯不同群體之間的功能差異(圖1G)。CD56dimCD16hi?NK細胞高表達細胞毒效應(yīng)基因，包括穿孔素(PRF1)和除GZMK外的大多數(shù)顆粒酶(GZMB、GZMA和GZMH)，而GZMK只在CD56brightCD16lo?NK細胞中表達。CD56brightCD16lo?NK細胞表達多種細胞因子基因，如IL18。我們還觀察到CD56brightCD16lo?c2和c4同時表達il -18及其受體IL18R1，這意味著il -18依賴性自分泌途徑在這些亞群中可能起著至關(guān)重要的作用。引人注目的是，CD56dimCD16hi?NK細胞亞群也可以表現(xiàn)出某些細胞因子的特異性表達，但與CD56brightCD16lo亞群具有不同的模式。特別是，CD56dim?CD16hi亞群c4-NFKBIA在所有NK細胞亞群中表現(xiàn)出相對較高的炎癥評分，主要表達CCL3、CCL4和CCL4L2，表明它們有能力招募其他免疫細胞，如T細胞。最近的研究將1型常規(guī)樹突狀細胞(cDC1s)募集到腫瘤與NK細胞聯(lián)系起來，通過NK細胞分泌XCL1、XCL2和CCL5來實現(xiàn)。我們的研究鑒定出了通過細胞類型特異性互補策略參與cDC1募集的多種NK細胞亞群。CD56brightCD16lo?c2和c4表達初級水平的XCL1和XCL2，而CD56brightCD16lo?(c1-GZMH和c3-CCL3)和CD56dimCD16hi?(c1-IL-32和c8-KLRC2) NK細胞優(yōu)先表達另一個cDC1趨化基因CCL5。此外，我們描述了激活和抑制受體的概況，觀察到NK細胞亞群的明顯變化。例如，KLRC1在CD56brightCD16lo?NK細胞中的表達水平高于CD56dimCD16hi?NK細胞，盡管不是特異性的，LAG3和TIGIT在c8-KLRC2中高表達。值得注意的是，與其他組織富集的CD56dimCD16hi亞群(c4-NFKBIA, c5-MKI67和c7-NR4A3)相比，c6-DNAJB1 NK細胞表現(xiàn)出最高的應(yīng)激評分和最弱的細胞毒性，表明它們的轉(zhuǎn)錄和功能表型存在顯著差異(圖1G)。綜上所述，我們以細粒度的亞群分辨率提供了NK細胞的詳細轉(zhuǎn)錄組譜。而不是分析NK細胞作為一個單一的群體，我們剖析NK細胞的亞群特異性分子特性，并揭示其未被重視的異質(zhì)性。
圖1
2. 不同腫瘤類型NK細胞的組織異質(zhì)性
接下來，我們評估了腫瘤浸潤NK細胞群在不同癌癥類型中的偏好，觀察到明顯的差異(Figure 2A)。例如，未成熟的CD56brightCD16lo?NK細胞在鼻咽癌和基底細胞癌中占主導(dǎo)地位，而成熟的CD56dimCD16hi?NK細胞在腎癌和肺癌中占主導(dǎo)地位，這與先前的報道一致。其他的，如結(jié)直腸癌和肝癌，沒有明顯的傾向(圖2A)。為了檢驗上述趨勢是否可以用器官結(jié)構(gòu)來解釋，我們分析了鄰近非腫瘤組織中主要NK細胞類型的內(nèi)在組成及其在腫瘤中的相應(yīng)變化。在某些類型的癌癥中，如結(jié)直腸癌，腫瘤組織的NK細胞組成與鄰近的非腫瘤組織相似。在肺癌、腎癌等腫瘤類型中，盡管腫瘤與鄰近非腫瘤組織中主要NK細胞類型保持不變，但CD56dimCD16hi?NK細胞的比例明顯降低(圖2B)。有趣的是，乳腺癌和食管癌腫瘤主要的NK細胞群與它們的鄰近非腫瘤組織相比是相反的(圖2C)。這些觀察結(jié)果表明，內(nèi)部器官特性和惡性腫瘤相關(guān)因素對形成NK細胞群的成分有復(fù)合的影響。
我們進一步從子集的角度探索NK細胞的癌癥類型特異性，并進行無監(jiān)督聚類，根據(jù)NK細胞亞群比例對所分析的癌癥類型進行分層。NK細胞亞群如c2-CX3CR1在胰腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中表現(xiàn)出強烈的偏好。在某些亞型的癌癥類型中觀察到高變異性。例如c4-NFKBIA和c7-NR4A3從頭頸部鱗狀細胞癌和甲狀腺癌到食管癌和鼻咽癌的中位數(shù)頻率顯著降低(圖2D)。盡管觀察到明顯的差異，但包括子宮內(nèi)膜癌、基底細胞癌和食管癌在內(nèi)的癌癥類型聚集在一起，均具有豐富的CD56brightCD16hi?c5-CREM和較少的c4-IL-7R NK細胞。特別值得注意的是，具有上述低飽和度階段的罕見CD56brightCD16hi?NK細胞亞群在黑色素瘤和白血病中大量存在，特別是在急性髓系白血病(AML)亞型中(圖2D)。NK細胞的這種低飽和度階段與AML患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期的降低有關(guān)。與其他NK細胞群相比，這些CD56brightCD16hi細胞在其極低的激活和抑制受體評分方面表現(xiàn)出獨特的表型和功能變化(圖2E)。目前基于NK細胞的治療側(cè)重于增強NK細胞的激活和壽命，但通常忽略了癌癥類型之間的異質(zhì)性和TME對NK細胞細胞毒性功能的抑制作用，這些都應(yīng)該在未來的治療策略中加以考慮。
圖2
3. RGS1是組織浸潤NK細胞的標志
如上所述，NK細胞成分從血液到組織都發(fā)生了顯著變化。同樣，在組織浸潤NK細胞和它們的血液對應(yīng)物之間檢測到廣泛的轉(zhuǎn)錄變化(圖3A-B)。先前的研究已經(jīng)確定了組織駐留NK細胞的幾種標記物，如CD69、CD103、CXCR6和CD49a。然而，我們發(fā)現(xiàn)ITGA1 (CD49a)、ITGAE (CD103)和CXCR6在單細胞轉(zhuǎn)錄組水平很少被檢測到，CD69在NK細胞中廣泛表達，包括血液來源的(圖3E)。此外，有報道顯示，這些標記物在特定組織的NK細胞群中優(yōu)先表達。這些促使我們以無偏的方式從泛癌的角度發(fā)現(xiàn)強大的NK細胞駐留標記。
我們選擇了血液和組織之間的差異表達基因，并進一步評估了它們的敏感性和特異性，以區(qū)分NK細胞的組織來源。因此，RGS1 (G蛋白信號1的調(diào)節(jié)因子)被明確識別，它只在腫瘤和鄰近非腫瘤組織的NK細胞中表達，而在血液中幾乎檢測不到(圖3C-D)。此外，RGS1的表達與KLF2、SELL等遷移信號相反(圖3E)。與上述常規(guī)組織駐留標記相比，RGS1具有更高的敏感性和特異性。接下來，我們直接比較了RGS1與ITGAE、CD69及其聯(lián)合在血液中的表達模式，發(fā)現(xiàn)RGS1單獨在血液中的檢出率最低，而RGS1/CD69聯(lián)合可以進一步提高組織中的陽性檢出率(圖3F)。此外，RGS1/CD69聯(lián)合在區(qū)分血液和非血液NK細胞方面比單獨使用具有更高的曲線下面積(AUC)值。值得注意的是，RGS1在分析的患者和癌癥類型中廣泛表達(圖3G-H)。
綜上所述，這些特征暗示了RGS1單獨或與CD69結(jié)合的潛在作用，在轉(zhuǎn)錄組水平上是組織浸潤NK細胞的優(yōu)良標記物。我們推測RGS1的表達可能減弱G蛋白的信號活性，導(dǎo)致NK細胞趨化遷移能力減弱，促進NK細胞駐留。RGS1在NK細胞中的作用機制有待進一步研究。
圖3
4. 腫瘤相關(guān)NK細胞程序及其特征
接下來，我們試圖闡明NK細胞在腫瘤中的明確特征。除了上述某些亞群在腫瘤特異性富集外，我們發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤組織相比，在腫瘤中，CD56brightCD16lo?c3-CCL3 NK細胞的細胞因子產(chǎn)量較低，表現(xiàn)為CCL3和CCL4的表達減少，并且在大多數(shù)癌癥類型中，c5-CREM NK細胞中XCL1和XCL2的表達減少，暗示它們在腫瘤中的功能轉(zhuǎn)換。然后，我們使用SCENIC識別了腫瘤浸潤性CD56brightCD16lo和CD56dim?CD16hi?NK細胞亞群的激活調(diào)控子。重要的是，腫瘤富集的c6-DNAJB1亞群表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄因子如KLF6和EGR3的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子與細胞毒性功能的抑制有關(guān)。
利用RNA速率，我們解碼了NK細胞的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)，在CD56brightCD16lo和CD56dimCD16hi?NK細胞中觀察到從血液富集的亞群到腫瘤浸潤群的明確定向流動(圖4A)。相應(yīng)的，RGS1的表達沿流速方向升高。我們發(fā)現(xiàn)CD56dimCD16hi?c6-DNAJB1 NK細胞位于速率末端，從而推斷為終末狀態(tài)(圖4A)。值得注意的是，來自鄰近非腫瘤組織的CD56dimCD16hi?NK細胞主要觀察到在UMPA圖上富含c7-NR4A3細胞; 相比之下，腫瘤來源的CD56dimCD16hi?NK細胞在富含c6-DNAJB1細胞的UMAP圖上占優(yōu)勢地位(圖4B)。與此一致的是，腫瘤富集的c6- DNAJB1 NK細胞的標記物，如DNAJB1和HSPA1A在腫瘤浸潤的CD56dimCD16hi?NK細胞群中高度表達(圖4C)。此外，我們觀察到c6-DNAJB1和c7-NR4A3 NK細胞中線粒體基因的表達水平相似，表明c6-DNAJB1 NK細胞的應(yīng)激表型與細胞質(zhì)量無關(guān)。由于c6-DNAJB1細胞在腫瘤中特異性富集，我們將這一群體稱為腫瘤相關(guān)NK (TaNK)細胞。
多重免疫熒光染色進一步證實了腫瘤中TaNK細胞的存在(圖4D)。我們還利用流式細胞術(shù)驗證了TaNK細胞(CD56dimCD16hi?HSP40+)在體內(nèi)腫瘤的富集。在1例肝內(nèi)膽管癌和6例HCC樣本中，我們發(fā)現(xiàn)了TaNK細胞，它們在腫瘤浸潤性CD56dimCD16hi?NK細胞中的比例高于對應(yīng)的鄰近肝組織，這與我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖4E)。
然后，我們使用擬時序推斷分析來研究CD56dimCD16hi?NK細胞的動態(tài)，發(fā)現(xiàn)TaNK細胞在CD56dimCD16hi?NK細胞的推斷擬時間內(nèi)越來越多地出現(xiàn)，并且在終末期富集，與RNA速率分析的結(jié)果一致。為了檢驗TaNK細胞的新特征，我們將基因表達譜與擬時間擬合。有趣的是，CD56dimCD16hi?NK細胞在過渡過程中表現(xiàn)出細胞毒性降低，抑制受體和應(yīng)激基因表達升高(圖4F)。
值得注意的是，在所有腫瘤浸潤的CD56dimCD16hi?NK細胞亞群中，末端TaNK細胞具有最低的細胞毒性和最高的應(yīng)激評分。相比之下，相應(yīng)的c7- NR4A3在鄰近的非腫瘤組織中富集，具有高度的細胞毒性(圖 4G)。通過對幾種癌癥類型進行多重免疫熒光染色，我們觀察到TaNK細胞表現(xiàn)出較低水平的GZMB (圖4H)。肝癌患者流式細胞術(shù)分析進一步證實，與CD56dimCD16hi?HSP40+?NK細胞相比，TaNK細胞腫瘤部位細胞毒性顆粒(顆粒酶B和穿孔素)表達較低，抑制受體CD158a (KIR2DL1)和CD158e (KIR3DL1)表達較高(圖4I -J)。這些結(jié)果表明，TaNK細胞可能與功能失調(diào)狀態(tài)有關(guān)。此外，我們還觀察到NR4A核受體家族隨著擬時間順序的增加而呈現(xiàn)的動態(tài)差異趨勢(圖4F)。c7-NR4A3 NK細胞高表達NR4A2和NR4A3，而TaNK細胞高表達NR4A1。有趣的是，NR4A1已被確定為T細胞功能障礙的關(guān)鍵介質(zhì)，并被認為有助于限制實體瘤中CAR - T細胞的功能。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，腫瘤中的TaNK細胞可能最終功能失調(diào)，并可能在TME中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖4
5. TaNK細胞與不良預(yù)后和免疫治療耐藥的關(guān)系
由于NK細胞和CD8+?T細胞表現(xiàn)出廣泛的表型和功能相似性，我們接下來研究了靶向CD8+?T細胞的免疫檢查點阻斷(ICB)療法是否也會影響NK細胞。在腫瘤浸潤性NK細胞和CD8+?T細胞中，TaNK細胞和耗竭T細胞(Tex)表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激狀態(tài)(圖5A)，提示它們參與腫瘤免疫應(yīng)答。均高度表達一系列抑制受體分子;然而，它們在各種免疫調(diào)節(jié)基因上具有不同的表達譜。傳統(tǒng)的免疫檢查點基因如PDCD1和CTLA4在TaNK細胞上幾乎不表達(圖5A)，這意味著它們不是抗PD -1/CTLA-4治療的直接靶點。因此，在TME和當前的ICB治療中，TaNK細胞可能與Tex細胞發(fā)揮不同的作用。
我們觀察到不同癌癥類型的TaNK細胞豐度存在顯著差異(圖5B)，腫瘤時期對TaNK細胞比例的影響很小(圖5C)。值得注意的是，在癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中，腫瘤中的高TaNK細胞信號與大多數(shù)癌癥類型的低生存率相關(guān)(圖5D-E)。我們進一步應(yīng)用基于深度學(xué)習(xí)的模型進行反卷積和細胞組成分析，發(fā)現(xiàn)高TaNK細胞頻率表明癌癥患者預(yù)后不良。此外，我們通過分析先前乳腺癌和黑色素瘤的ICB治療研究中預(yù)處理腫瘤的scRNA-seq數(shù)據(jù)，進一步研究了TaNK細胞是否與ICB治療應(yīng)答相關(guān)(圖5F)。引人注目的是，在兩種癌癥類型中，無應(yīng)答患者中觀察到的TaNK細胞比例高于應(yīng)答患者。進一步利用來自各種癌癥(包括黑色素瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌)的已發(fā)表的大量數(shù)據(jù)，我們驗證了無應(yīng)答患者比應(yīng)答患者表現(xiàn)出更強的TaNK細胞信號(圖5G)。
我們推測，長期浸潤可能賦予腫瘤中TaNK細胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致其對惡性細胞的無效殺傷。TaNK細胞的富集與對抗腫瘤的免疫反應(yīng)受損以及對當前ICB治療的低敏感性有關(guān)。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了TaNK細胞在腫瘤中的潛在作用，并為NK細胞免疫療法的合理設(shè)計提供了參考。
圖5
6. TME中塑造腫瘤浸潤NK細胞功能的潛在介質(zhì)
為了深入了解NK細胞在TME中的調(diào)控程序，我們利用CellPhoneDB來探測NK細胞和其他CD45+免疫細胞(包括T細胞和髓系細胞)之間潛在的細胞-細胞相互作用。與T細胞相比，除肥大細胞外，大多數(shù)髓系細胞類型與CD56dimCD16hi?NK亞群表現(xiàn)出強烈的潛在相互作用(圖6A)。特別有趣的是，TaNK細胞被預(yù)測通過ANXA1調(diào)節(jié)多種髓系細胞類型，ANXA1是一種在炎癥反應(yīng)中與免疫抑制和誘導(dǎo)巨噬細胞重編程相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖6B)。這表明功能失調(diào)的NK細胞可能具有抑制TME中促炎巨噬細胞的潛力。為了進一步闡明NK細胞來源的ANXA1在巨噬細胞中的作用，我們對肺癌和肝癌的腫瘤樣本進行了多重免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)了一個ANXA1+?NK細胞群。與遠離ANXA1+?NK細胞的巨噬細胞相比，靠近ANXA1+?NK細胞的巨噬細胞表現(xiàn)出較低的活化標志物CD86(圖6C-D)和較高的抗炎標志物轉(zhuǎn)化生長因子b (TGF-b)的表達水平(圖6E-F)。
值得注意的是，在樹突狀細胞(DC)亞群中，LAMP3+?DC，最近表征的成熟cDCs(也稱為mregDC)顯示出與CD56dimCD16hi?NK細胞最強的相互作用潛力(圖6A)。多重免疫熒光分析顯示，LAMP3+?DCs與NK細胞共定位(圖6J)。此外，預(yù)測它們之間的相互作用通過IL-15-IL-15受體和NECTIN2-TIGIT相互作用軸介導(dǎo)(圖6B)。重要的是，LAMP3+?DC在轉(zhuǎn)錄組水平上表達免疫群體中最高水平的IL15、PVRL2 (NECTIN2)和PVR(圖6G)。流式細胞術(shù)也證實了IL-15在LAMP3+?DC中的高表達(圖6H)。IL-15已被確定為維持NK細胞壽命的穩(wěn)態(tài)相關(guān)細胞因子，并用于NK細胞輸注和體外繁殖。相比之下，TIGIT作為抑制受體有助于抑制NK細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外，在TCGA數(shù)據(jù)集中，LAMP3+?DC的豐度與CD56dimCD16hi?NK細胞相關(guān)(圖6I)。接下來，我們研究了LAMP3+?DC在腫瘤中的具體調(diào)控過程，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤的LAMP3+DC與鄰近非腫瘤組織相比，IL15的表達較低(圖S6K)，這表明LAMP3+?DC可能對TME中CD56dimCD16hi?NK細胞的激活作用受損。事實上，物理上接近LAMP3+?DC的NK細胞表達顆粒酶B的水平較低(圖6J-K)。總之，我們的分析表明，在TME中，LAMP3+?DC對CD56dimCD16hi?NK細胞的異常調(diào)節(jié)。
圖6
7. 外周血NK細胞亞群的不同轉(zhuǎn)錄組模式
NK細胞在血液中的淋巴細胞室中占相當大的比例，但它們在腫瘤誘導(dǎo)的外周免疫系統(tǒng)中的作用相對不明確。我們的圖譜包含來自35名健康供者的血液來源NK細胞的9個scRNA數(shù)據(jù)集，使我們能夠探測腫瘤患者外周血中NK細胞的特異性改變。
我們首先比較了來自健康供者的循環(huán)NK細胞與來自腫瘤患者的循環(huán)NK細胞的轉(zhuǎn)錄組特征，不同數(shù)據(jù)集的健康供者的循環(huán)NK細胞顯示出高度相似性(圖7B)。相比之下，對于來自腫瘤患者的循環(huán)CD56brightCD16lo細胞，我們觀察到與健康供者的轉(zhuǎn)錄組存在顯著差異;在所分析的所有癌癥類型中，循環(huán)CD56dimCD16hi細胞的差異甚至更為顯著(圖7A)。值得注意的是，腫瘤患者在NK細胞亞群中表現(xiàn)出顯著的組成變化，這種模式似乎是癌癥類型特異性的(圖7C)。例如，在結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎癌和HCC中，循環(huán)CD56brightCD16lo?c3-CCL3 NK細胞的比例增加，但在其他被分析的癌癥類型中沒有增加。
接下來，我們將重點放在CD56dimCD16hi?c8-KLRC2適應(yīng)性NK細胞上，該細胞在某些癌癥類型如結(jié)直腸癌和胃癌中富集(圖7D)。適應(yīng)性NK細胞被認為是CAR NK細胞的一個有吸引力的來源，因為它們具有增強細胞因子反應(yīng)的效應(yīng)特性和對免疫抑制效應(yīng)的內(nèi)在抗性。特別有趣的是，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，與其他循環(huán)NK細胞相比，這些細胞特異性表達MHC II類基因(圖7E)。我們還檢查了這些NK細胞在腫瘤患者中的功能變化，發(fā)現(xiàn)與健康供體相比，患者來源的適應(yīng)性NK細胞的功能基因和MHC II類基因的表達明顯更高(圖7F, 7H)，這意味著它們在腫瘤患者中處于高度激活狀態(tài)。我們通過流式細胞術(shù)進一步證實，與健康供者相比，HCC患者循環(huán)NK細胞中MHC II類分子的高表達(圖7G)。因此，在患者源性適應(yīng)性NK細胞中上調(diào)的基因參與了免疫效應(yīng)過程的正調(diào)控等途徑(圖7I)。綜上所述，我們的分析表明，循環(huán)NK細胞參與了腫瘤進展過程中外周免疫環(huán)境的系統(tǒng)性變化。
圖7
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結(jié)論
NK細胞在對抗腫瘤進展的先天免疫應(yīng)答中起著不可或缺的作用。為了描述他們在腫瘤微環(huán)境中的表型和功能多樣性，我們對716名癌癥患者的NK細胞做了綜合的單細胞RNA測序分析，涵蓋了24種癌癥類型。我們在腫瘤類型特異的種類中觀察到NK細胞組成的異質(zhì)性。值得注意的是，我們鑒定出了一組腫瘤相關(guān)的NK細胞，他們在腫瘤中富集，顯示出抗腫瘤功能受損，并與不良預(yù)后及免疫治療耐受有關(guān)。特定的髓系細胞亞群，特別是LAMP3+DC細胞，可能介導(dǎo)NK細胞抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)?？傊?，我們的綜合分析增強了目前從泛癌癥角度對NK細胞的理解，闡明了NK細胞群體結(jié)構(gòu)以及腫瘤誘導(dǎo)的局部和全身NK細胞反應(yīng)的見解。為了方便廣泛的研究社區(qū)使用我們的數(shù)據(jù)，已經(jīng)開發(fā)了一個交互式門戶網(wǎng)站(http://pan-nk.cancer-pku.cn/)來分析和可視化我們的單細胞數(shù)據(jù)。我們設(shè)想我們的大規(guī)模數(shù)據(jù)可以進一步促進NK細胞免疫療法在更多癌癥患者中的應(yīng)用。
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參考文獻：
Tang F, Li J, Qi L, Liu D, Bo Y, Qin S, Miao Y, Yu K, Hou W, Li J, Peng J, Tian Z, Zhu L, Peng H, Wang D, Zhang Z. 2023. A pan-cancer single-cell panorama of human natural killer cells. Cell, 186(19):4235-4251. doi: 10.1016/j.cell.2023.07.034.