冠狀病毒包含E (envelope protein)、M (membrane protein)、N (nucleocapsid protein)和S (spike protein)四種典型結構蛋白。其中，S蛋白包含S1和S2兩個功能性亞基，S1負責與宿主細胞受體結合，S2負責將S蛋白錨定在病毒膜上并介導病毒膜與宿主細胞膜的融合。所以S蛋白是介導冠狀病毒進入宿主細胞的主要蛋白，也是感染后引起宿主免疫系統產生中和性抗體的主要靶標。

?

S蛋白在冠狀病毒的表面會形成突出的同型三聚體，2020年2月份Science重磅報道了2019-nCoV S蛋白三聚體的cyro-EM結構，不僅為解釋2019-nCoV S蛋白與ACE2蛋白的親和力比SARS S高10-20倍提供了結構依據，也進一步闡釋了S蛋白三聚體結構對于介導冠狀病毒進入宿主細胞的重要作用。與SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白類似，2019-nCoV S蛋白三聚體結構中，每一個S蛋白單體與相鄰的S蛋白相互纏繞形成緊湊的mushroom-shaped同型三聚體，其中S1亞基的SD1/SD2 domain與相鄰S的S2亞基相互作用，這種相互纏繞的模式使得S1形成類似冠狀的結構從而將S2 trimer鎖定在prefusion的狀態（如Fig.1），而S1 RBD與受體ACE2的結合以及S1/S2邊界處的酶切斷裂，都會使S1三聚體冠狀結構移除，從而造成S2大規模的構象變化，進而導致病毒膜與宿主膜融合(Fig.2)?？梢哉f，S蛋白的trimer結構對于穩定S2 trimer prefusion的構象至關重要，也會直接影響其與ACE2蛋白的結合活性。

Fig.1 Front and top view of the trimeric coronavirus spike protein ectodomain obtained by cryo-electron microscopy analysis. Three S1 protomers (surface presentation) are colored in red, blue, and green. The S2 trimer (cartoon presentation) is colored in light orange.

?

Fig.2 Schematic of 2019-nCoV S primary structure(colored by domain) and A single promoter of 2019-nCoV S with the RBD in the down (left) and up conformation(right).

?

因此，具有正確結構的三聚體S蛋白對于抗病毒藥物的開發具有重要意義，重組表達S蛋白產品在研發和生產質控過程中需要對其分子量進行準確測定，證明S蛋白在生理溶液中是以正確的天然三聚體狀態存在，保證其應有的正確結構和功能。

?

常見的蛋白分子量測定技術有相對定量法 (SEC-HPLC，高效分子篩液相色譜) 和絕對定量法（SEC-MALS，多角度激光散射），兩種技術都可以方便的測定溶液中生理條件下蛋白的分子量，但由于原理上的不同，導致檢測結果準確度存在顯著差異 (表1) 。SEC-HPLC需要借助標準蛋白進行分子量內插測定，實際應用中常常受到多種因素的干擾，無法準確得到蛋白質真實分子量和聚集狀態。MALS技術 (Multi-Angle Light Scattering) 是基于蛋白的分子量與光散射的強度直接相關來測定蛋白絕對分子量的技術，無需使用標準蛋白，不依賴于洗脫保留時間，也就避免了SEC分子篩測定分子量的諸多問題。SEC-MALS技術中，通過SEC分離后的各組份進入多角光散射檢測器，激光照射到分析物時會發生光的散射，MALS通過多個角度同時測定散射光的強度 (Fig.3a) 。從公式b1中 (Fig.3b1) 可以看出散射光強度正比于摩爾質量、濃度、折光指數增量的平方，用公式b2（Fig.3b2）可以直接計算出分析物的絕對分子量。由此可見，MALS技術不依賴于蛋白的洗脫保留時間來計算蛋白分子量，因此測定結果較傳統的SEC-HPLC更加準確可靠。

?

表1. SEC-HPLC和SEC-MALS兩種檢測方法的比較

?

?

基于SEC-MALS方法的獨特優勢，ACROBiosystems獨家推出以正確三聚體形式存在的高活性S蛋白，并使用SEC-MALS技術對蛋白的分子量和聚體形式進行了嚴格驗證。結果顯示，全長三聚體S蛋白在溶液生理條件下以正確的三聚體形式存在，且三聚體含量達到85%以上，同時，經SPR驗證ACE2親和力為35nM，ELISA中EC50為0.2nM，具有非常理想的天然活性。

?

天然三聚體S活性蛋白的上市，有助于更加深入地理解病毒感染機理，為快速藥物篩選和藥物開發提供有力的支持。

?

2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (MALS verified)

SPN-C52H8

?

全長三聚體S蛋白與ACE2蛋白結合活性：親和力常數35.3 nM (SPR）

Human ACE2, Fc Tag (Cat. No. AC2-H5257) Captured on CM5 chip via anti-human IgG Fc antibodies surface can bind 2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (Cat. No. SPN-C52H8) with an affinity constant of 35.3 nM as determined in a SPR assay (Biacore 8K).

?

全長三聚體S蛋白與ACE2蛋白結合活性：EC50為0.2 nM (ELISA）

Immobilized Biotinylated Human ACE2 / ACEH Protein, Fc, Avi tag? (Cat. No. AC2-H82F9) at 1 μg/mL (100 μL/well) on streptavidin precoated (0.5 μg SA/well) plate, can bind 2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (Cat. No. SPN-C52H8) with a linear range of 1-20 ng/mL.

?

產品列表

（2019-nCoV Inhibitor Screening Kit即將面市，敬請關注，歡迎預購！

點擊下方圖片可查看在線產品更多信息及預購產品預計上線時間?。?/span>

?

>其他相關文章

>HPLC驗證的2019-nCoV蛋白加速抗病毒藥物的開發—ACROBiosystems

>蛋白聚體，你真的分析對了么？——ACROBiosystems

>生物素標記2019-nCoV蛋白加速藥物的篩選和驗證—ACROBiosystems

>經SPR/BLI驗證天然結合活性的新冠病毒蛋白上線！—ACROBiosystems

?

?

參考資料

1. Wrapp D, et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike prefusion conformation. Science. 2020 Mar.

2. R.J.G. Hulswit, et al., Coronavirus Spike Protein and Tropism Changes. Advances in Virus Research. 2016 Aug.