乳腺癌是最常見的癌癥，在2022年美國癌癥協會發表的癌癥統計報告中指出，2014年至2018年期間，女性乳腺癌的發病率持續緩慢增長（約每年增加0.5%），而在2022年度女性確診的癌癥中，乳腺癌、肺癌和結直腸癌發病率占所有癌癥種類的51%，僅乳腺癌就占近三分之一^【1】。

乳腺癌通常從導管過度增殖開始，經過各種致癌因素的不斷刺激后，再發展成良性腫瘤甚至轉移性癌^【2】。乳腺癌的發生和發展機制有兩種假設理論：癌癥干細胞理論和隨機理論。癌癥干細胞理論認為，所有腫瘤亞型都來自相同的干細胞或祖細胞，干細胞或祖細胞中獲得性遺傳和表觀遺傳突變將導致不同的腫瘤表型；而隨機理論則認為，每種腫瘤亞型都是從單細胞類型（干細胞，祖細胞或分化細胞）開始的，隨機突變可以在任何乳腺細胞中逐漸積累，導致它們轉化為腫瘤細胞。雖然這兩種理論都得到了大量數據的支持，但都不能完全解釋人類乳腺癌的發病原因。因此，在體外進行培養的乳腺癌類器官模型能夠作為患者的“替身”，在研究致病機理的同時，能夠幫助患者預測多種治療方案的效果，是個性化醫療的有利工具。

本篇文章基于Nature protocols^【3】和Cell^【4】發表的兩篇文章，整理了病人組織來源的乳腺癌類器官培養方案。

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圖1. 病人組織來源的乳腺癌類器官培養方案^【3】

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細胞來源

活檢樣本或手術樣本

培養基配方

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組織處理

1. 將新鮮乳腺癌組織樣本放入預冷的含有1% BSA的DMEM-F12培養基中，剔除脂肪組織和壞死的腫瘤組織（通常為黃色或白色），只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。

2. 將組織轉移到含有5 mL預冷的PBS溶液中清洗，去除血液和碎片。為防止污染，需要多次重復此步驟至液體變澄清。

3. 吸出PBS，加入含有1% BSA的DMEM-F12培養基中。將組織切割為0.5–1 mm³的小塊，此步驟可以留存適量組織用于測序、免疫組化分析等。

4. 將剩余組織塊切碎，并加入1 ml含有1% BSA的DMEM-F12培養基，用p1000吸頭將腫瘤碎片懸浮液轉移到含有5 ml解離培養基的離心管中，輕輕震蕩混勻后，放置于37℃恒溫搖床中震蕩解離1-2h，調整轉速約為140 rpm。每30分鐘將離心管上下顛倒混勻5-10次，并取少量在顯微鏡下觀察。當鏡下出現5-10個細胞/簇時，停止解離。

5. 加入1ml FBS終止消化。

6. 將懸浮液經過100μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。

7. 將過濾的細胞懸液在4℃條件下450g離心5min。

8. 若細胞沉淀有明顯的紅色，則將細胞重懸于5ml的紅細胞裂解液中，冰上孵育10min使紅細胞裂解。

9. 向細胞懸液中加入5ml DMEM-F12沖洗細胞一次，離心收集細胞沉淀后，加入1-2ml DMEM-F12重懸細胞，并進行臺盼藍染色觀察活細胞占比。

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類器官培養

10. 將凍存的BME在4℃下過夜解凍，在冰上以200μl:50μl的體積比將BME與細胞懸液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。

11. 從37℃培養箱中取出預熱的12孔板，將100μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。

12.將12孔板翻轉后，室溫放置5min；然后轉移至37℃，5%CO₂的培養箱中，正置孵育30min，使BME固化。

13. 向每個孔中緩慢滴加 750 μl 預熱的類器官培養基，確?；|膠被完全覆蓋。放于37℃，5%CO₂的培養箱中培養，每2-4天更換培養基。

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類器官傳代

14. 吸出類器官培養液，加入2ml預冷的DMEM-F12培養基，機械吹打后加入2 mL TrypLE Express。室溫孵育1–5min后，用移液器多次吹打，從基質膠中釋放類器官。

15. 用含有10%FBS的DMEM-F12培養基終止消化，在4℃條件下300g離心5min。

16. 用冷PBS清洗后，再次4℃條件下300g離心5min。

17. 將所得沉淀按照1：2-1：8的比例重復10-13步驟（具體比例通過類器官的匯合度確定），完成傳代。

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類器官凍存

18. 當顯微鏡下類器官的尺寸達到100-150μm時，可以考慮進行凍存。

19. 取3-4個孔的類器官，消化離心后取細胞沉淀，加入1ml細胞凍存液。

20. 將細胞重懸后轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。

21. 第二天，將樣品轉移到液氮中長期儲存。

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類器官復蘇

22. 將液氮凍存的乳腺癌類器官放置在37℃水浴鍋中進行解凍，水浴時間不宜超過2min。

23. 將細胞懸液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM-F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下300g離心5min，取細胞沉淀。

24. 將所得沉淀重復10-13步驟，完成乳腺癌類器官的復蘇。

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圖2. 不同類型乳腺癌來源的乳腺癌類器官形態特征^【3】

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乳腺癌類器官應用前景

類器官模型可以有效地反映腫瘤的異質性，并且通過測序結果證實，大多數類器官可以很好地保留來源組織的基因特性。Goldhammer N等人^【5】提供的數據表明，在早期傳代中，病灶組織和體外培養類器官之間的相似度最高。在過去的幾年中，隨著消化步驟的優化和實驗技術的不斷改進，乳腺癌類器官的培養成功率已提高到~80%，這也將成為進一步研究乳腺癌的有效模型（圖3）。

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圖3.乳腺癌類器官的進化過程^【6】

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Cassidy 等人^【7】利用乳腺癌類器官篩選了18種抗癌藥，發現了培美曲塞聯合卡鉑、吉西他濱和吡羅替尼的用藥比其他方案對乳腺癌抑制率高出60%；對乳腺癌類器官進行WGS測序，可以尋找出對Olaparib和Nilapali更敏感的高表達BRCA1/2患者。因此，通過對乳腺癌類器官的基因檢測和藥物檢測，擴大了患者的治療選擇范圍，也為患者提供了更精準的治療方案。

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參考文獻

【1】Rebecca L. Siegel MPH, et al. Cancer statistics, 2022[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2022, 72(1): 7-33.

【2】Sun Y S, et al. Risk factors and preventions of breast cancer[J]. International journal of biological sciences, 2017, 13(11): 1387.

【3】Dekkers J F, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids[J]. Nature protocols, 2021, 16(4): 1936-1965.

【4】Sachs N,, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity[J]. Cell, 2018, 172(1-2): 373-386. e10.

【5】Goldhammer N, et al. Characterization of organoid cultured human breast cancer[J]. Breast Cancer Research, 2019, 21(1): 1-8.

【6】YU, Jin; HUANG, Wei. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells, 2020, 13(3): 295-304.

【7】Cassidy J W, et al. Patient-derived tumour xenografts for breast cancer drug discovery[J]. Endocrine-related cancer, 2016, 23(12): T259-T270.

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