期刊：Circulation
影響因子：37.8
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導語
發生過程中，平滑肌細胞（SMC）在動脈粥樣硬化刺激下，增殖、去分化和遷移到內膜病變中。其轉化成其他表型的細胞在冠心?。╟oronary artery disease，CAD）發病中起到了重要作用，包括轉化成類成纖維細胞、類軟骨細胞等，這些細胞組成了動脈粥樣斑塊的主要細胞群。
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研究問題
·表觀遺傳和轉錄機制如何介導SMC轉化為其他細胞
·SMC及轉化后的細胞如何影響冠心病的發生
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研究技術
10X?單細胞RNA測序、10X單細胞ATAC-seq、ChIP-seq、IHC
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研究內容
作者采用CRISPR-Cas9技術，鑒定出遠端調控Zeb2表達的超級增強子。Zeb2通過調節染色質重塑，抑制Notch和TGFβ信號通路，改變SMC表觀遺傳軌跡，調控SMC表型轉化。Zeb2的SMC特異性缺失導致SMC無法關閉收縮的表達，呈現出成纖維細胞樣（fibromyocyte，FMC）表型，加速了軟骨肌細胞（chondromyocyte，CMC）的形成，反映了人類冠狀動脈中高風險動脈粥樣硬化斑塊的特征。
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研究路線
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研究結果
1.?CAD相關的染色體2q.22.3變異調控ZEB2表達
既往全基因組關聯分析發現染色體2q.22.3與CAD的發病率顯著相關（Fig?1A），該區域距離最近的基因為ZEB2。GWAS數據分析發現，2q.22.3區域的SNP單倍型塊與CAD風險顯著相關，且在物種間保守（Fig 1B），并可以劃分為6個高保守區域（Fig 1C）。采用人SMC組織進行H3K27ac ChIP-seq發現，該區域屬于功能型增強子（Fig 1D），Hi-C證實其行成loop結構結合ZEB2啟動子（Fig 1D）。GWAS分析eQTL數據，發現該區域的SNP與CAD發生相關，與ZEB2的表達也明顯相關（Fig 1E）。使用CRISPR-Cas9敲除該區域后（Fig 1F），ZEB2表達顯著降低（Fig 1G）。使用dCas9-KRAS特異性分別抑制6個保守區域的功能（Fig 1H），發現其中3個區域調控ZEB2表達（Fig 1I）。
Fig. 1 人CAD相關的染色體2q22.3區域調控ZEB2表達。
2.?SMC表型轉化中Zeb2表達激活
為了研究在動脈粥樣硬化損傷中，表達Zeb2的細胞，作者使用譜系追蹤的動脈粥樣硬化小鼠模型的主動脈根部進行單細胞測序（Fig 2A）。無動脈粥樣硬化時，Zeb2表達于巨噬細胞和成纖維細胞中，譜系示蹤的SMC細胞中不表達Zeb2（Fig 2B-2D）。值得注意的是，在動脈粥樣硬化斑塊中，隨著SMC轉化，Zeb2表達逐漸激活（Fig 2C）。RNA原位雜交發現，Zeb2表達于斑塊帽子結構下方的譜系示蹤SMC細胞中（Fig 2E-2G）。
為了鑒定使用ZEB2增強子的細胞，及了解Zeb2如何調控表觀基因組，作者進行了單細胞ATAC-seq（scATC-seq）。采用擬表達矩陣進行降維聚類，鑒定出6種細胞（Fig 2H）。不同類型的細胞中可視化2q.22.3區域的染色質開放程度，發現巨噬細胞和內皮細胞中該區域處于關閉狀態，轉化的SMC細胞中處于開放狀態（Fig 2I）。整合scRNA-seq和scATAC-seq中的SMC細胞數據，降維分析發現SMC可以聚類為靜息態和轉化態SMC（Fig 2J）。Monocle軟件構建SMC演化狀態（Fig 2K），平滑肌細胞起始于收縮基因高表達狀態，隨著SMC轉化為FMC，其表達量逐漸降低（Fig 2L）。Zeb2表達伴隨于Zeb結合位點的可及性降低（Fig 2M-2O）。隨著演化軌跡，出現CMC細胞時，Zeb2表達丟失，Zeb結合基序的可及性恢復。這些結果表明，Zeb2作為表觀遺傳抑制因子，結合染色質后，會關閉其結合區域的染色質可及性（Fig 2P）。
Fig. 2?Zeb2降低染色質可及性調控SMC細胞表型轉化
3.?敲除Zeb2特異性調節轉化態SMC的表觀遺傳軌跡
對SMC細胞條件性敲除Zeb2的動脈粥樣硬化小鼠進行scATAC-seq和scRNA-seq，研究Zeb2調控SMC轉化的機制（Fig 3A）。scATAC-seq降維聚類發現（Fig 3B），缺失Zeb2廣泛改變轉化態SMC細胞的染色質可及性（Fig 3C）。SMC細胞亞群細分，轉化態SMC主要存在于Zeb2敲除的樣本中（Fig?3D-3E），成熟SMC標記基因Cnn1等的染色質可及性增加（Fig?3F-3G），意味著Zeb2在轉化態SMC中具有抑制成熟SMC標記基因的作用，還可能抑制SMC轉化為軟骨細胞表型。差異開放區域也富集了Notch和TGFβ的效應因子Rbpj和Smad結合基序（Fig 3H），Zeb2的表達與Notch靶基因的表達也呈現負相關關系（Fig 3I）。GREAT算法發現，Zeb2最可能的靶基因富集于EMT相關通路和TGFβ信號通路（Fig?3J），說明Zeb2可直接調控TGFβ響應基因。
Fig. 3 缺失Zeb2改變SMC的表觀遺傳軌跡
4.?SMC特異性敲除Zeb2降低斑塊中的轉化態SMC細胞
scRNA-seq降維聚類發現，缺失Zeb2只導致轉化態SMC的轉錄組和表型變化（Fig 4A-4C）。對譜系追蹤的SMC細胞亞群細分，缺失Zeb2顯著降低轉化態SMC細胞數目（Fig?4D-4I），總SMC細胞數不變的情況下，CMC細胞百分比增加，FMC細胞百分比降低（Fig?4H-4I），敲除Zeb2促進SMC向CMC轉化，類成纖維細胞的重塑態SMC基因MMP3和Cxcl12表達降低（Fig 4K-4N）。RNA原位雜交顯示，Zeb2敲除時，成熟SMC基因Cnn1分布于斑塊帽子區域（Fig?4O-4R），軟骨標記基因Col2a1在靠近纖維帽區域的斑塊體中的細胞中表達（Fig 4S-4T）。
Fig. 4 缺失Zeb2抑制SMC轉化為FMC，促進轉化為CMC。
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文章結論
本研究通過GWAS確定了ZEB2作為新的CAD相關基因，scRNA-seq和scATAC-seq發現ZEB2特異性調控SMC細胞的基因表達和染色質可及性，促進SMC轉化為FMC，抑制SMC轉化為CMC。
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參考文獻：
Cheng P, Wirka RC, Shoa Clarke L, Zhao Q, Kundu R, Nguyen T, Nair S, Sharma D, Kim HJ, Shi H, Assimes T, Brian Kim J, Kundaje A, Quertermous T.?ZEB2?Shapes the Epigenetic Landscape of Atherosclerosis. Circulation. 2022 Feb 8;145(6):469-485. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.057789. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34990206; PMCID: PMC8896308.