炎癥性腸病（IBD），包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病，是臨床上主要的慢性和復發性腸道炎癥疾病。在其他器官（如肝臟）存在異常的IBD患者中，往往存在IBD的嚴重程度增加，然而，肝臟疾病加重IBD的機制尚未完全了解。在哺乳動物中，肝臟通過色氨酸從頭合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺），并將煙酰胺（NAM）釋放到血液中，以供外周組織通過NAD⁺補救途徑來滿足NAD⁺的需求。越來越多的證據表明，NAD⁺代謝在編程腸道結腸炎期間的免疫反應中起作用，但尚不清楚主要循環自肝臟的NAD⁺是否通過調節腸道免疫細胞來影響結腸炎的組織修復。

近期，山東大學齊魯醫院消化內科李石洋教授、左秀麗教授和基礎醫學院袁得天教授在Advanced Science發表了題為Sensing of liver-derived nicotinamide by intestinal group 2 innate lymphoid cells links liver cirrhosis and ulcerative colitis susceptibility的研究文章，通過代謝組學、單細胞轉錄組學、基因編輯和骨髓移植等技術手段，揭示了慢性肝病擾亂肝臟NAD⁺代謝，導致經肝-腸軸到達腸道的NAD⁺合成前體物NAM減少，損害腸道2型固有淋巴樣細胞（ILC2s）的組織修復功能，繼而在并發UC時加重疾病。（麥特繪譜提供¹³C₆-Glucose代謝流檢測服務）

研究思路

圖1. 技術路線

研究結論

1. 肝損傷和潰瘍性結腸炎的癥狀相關

首先研究了肝損傷對結腸炎的影響，采用回顧性圖表分析了UC患者血清中丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)水平分類的潰瘍性結腸炎內鏡嚴重程度指數(UCEIS)，發現肝損傷加重了UC患者的結腸炎癥狀，兩者呈現正相關關系，該結論在四氯化碳（CCL4）誘導和膽管結扎（BDL）肝損傷結合DSS實驗性結腸炎小鼠模型中得到驗證。

圖2. 肝損傷與UC和實驗性結腸炎的嚴重癥狀相關

2. 肝損傷損害人和小鼠NAD⁺代謝

進一步探索肝損傷加重結腸炎相關的機制，采用非靶向代謝組學對健康供體和肝硬化患者的血漿進行研究，發現有67種代謝物在肝硬化患者中減少，KEGG分析發現輔助因子的生物合成途徑變化最大，這是由L-絲氨酸、煙酰胺（NAM）、泛酸和視黃醇水平降低，以及脫氧膽酸3-葡糖醛酸和L-酪氨酸水平的增加造成的。對肝硬化患者血漿NAM進行檢測，發現健康人群的NAM水平顯著高于肝硬化患者。

RNA-seq數據顯示非酒精性脂肪性肝炎和酒精性肝炎患者肝臟樣本中，參與NAD⁺從頭合成和補救合成途徑的關鍵酶（TDO2、HAAO、QPRT）mRNA水平降低。在肝損傷小鼠模型中進行驗證，發現肝臟中Tdo2、Ido2和Kmo的mRNA水平，以及肝臟NAD⁺、血漿NAM和腸道NAD⁺的水平均有所降低。

使用AAV2/8載體攜帶針對QPRT的mir30-shRNA（Qprt-KD），特異性敲低肝臟中的QPRT基因，成功降低了肝臟NAD⁺、血漿NAM和腸道NAD⁺的水平，在DSS誘導的結腸炎模型中，Qprt-KD小鼠表現出加重的疾病癥狀，而補充NMN（煙酰胺單核苷酸，NAD⁺前體）能夠逆轉這一趨勢，表明肝臟NAD⁺代謝對結腸炎進展有重要影響。

圖3. 肝損傷損害人和小鼠NAD⁺代謝

3. 肝損傷破壞腸道ILC2s

在分子層面繼續探索肝損傷加劇結腸炎的機制，采用單細胞轉錄組學對CCL4處理組小鼠進行研究，發現B/T/ILCs（固有淋巴細胞）減少。通過流式細胞術分析和小鼠模型實驗，確認CCl4處理減少了腸道ILC2s產生的效應分子Areg、IL-5和IL-13。將純化的腸道ILC2s回輸到CCl4處理的小鼠中，隨后進行DSS處理，發現恢復ILC2s功能能夠緩解CCl4加劇的DSS結腸炎。

圖4. 肝損傷破壞腸道ILC2s

4. 腸道ILC2s功能維持依賴于NAD⁺補救合成途徑

為了評估NAD⁺代謝是否直接調控ILC2s，使用不同的抑制劑來阻斷NAD⁺合成的不同步驟，GTN（NMNAT的抑制劑）顯著抑制了ILC2s的細胞活性和效應分子的產生，表明NAD⁺的生成對ILC2s的功能至關重要；FK866（NAMPT的抑制劑）顯著降低了ILC2s的存活率和細胞因子產生，進一步證明了NAD⁺補救合成途徑對ILC2s功能維持的重要性。

圖5. 腸道ILC2s維持依賴于NAD⁺補救合成途徑

5. NAD⁺調節ILC2s的機制

NAD⁺作為電子受體，在糖酵解和三羧酸循環（TCA）中接受高能電子，最終將這些電子傳遞給電子傳遞鏈（ETC）的復合體I，驅動氧化磷酸化過程，這是細胞產生三磷酸腺苷的主要途徑。

ILC2s的SMART測序轉錄譜顯示NAD⁺合成抑制劑FK866處理后，大量基因表達發生變化，特別是細胞周期和氧化磷酸化途徑相關基因的下調。進一步的代謝組學分析顯示，IL-33激活ILC2s時，NAD⁺及TCA循環中間產物檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸等濃度增加，表明NAD⁺對TCA循環和氧化磷酸化的促進作用。

使用¹³C標記的葡萄糖追蹤ILC2s探究NAD⁺是否通過TCA循環代謝產物調控ILC2s，結果顯示FK866處理導致ILC2s中丙酮酸和蘋果酸積累，減少了琥珀酸及其¹³C標記的同位素體，以及NAD⁺和NADH的含量。補充TCA循環中間產物對NAD⁺和NADH水平無顯著影響，但琥珀酸能夠部分恢復FK866抑制的ILC2s功能，表明NAD⁺可以通過支持琥珀酸生成來維持ILC2s。

使用丙二酸單乙酯鉀鹽（EM-K⁺）阻斷琥珀酸向ETC的電子傳遞時，琥珀酸對FK866處理的ILC2s恢復作用被消除，進一步論證了NAD⁺通過支持TCA循環產生的琥珀酸維持ETC，從而保持ILC2s的正常功能。

圖6. NAD⁺通過支持琥珀酸鹽維持腸道ILC2s

6. NAD⁺以細胞內在方式調節腸道ILC2s

從遺傳學的角度進一步探究NAD⁺對ILC2s的調控作用，利用基因編輯技術構建Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠模型，發現表達Areg、IL-5和IL-13的ILC2s數量均有所減少。從Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠中分離出ILC2s，并在體外培養系統中加入IL-2、IL-7、IL-25和IL-33等細胞因子，與野生型對照小鼠相比，Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠來源的ILC2s在數量、存活率以及效應分子產生方面均顯著降低。通過添加NMN或琥珀酸治療，可以恢復這些ILC2s的存活率和功能，支持了NAD⁺通過琥珀酸向電子傳遞鏈供電子以維持腸道ILC2s的存活和功能的機制。

通過混合骨髓移植實驗進一步證實了NAMPT在ILC2s中的內在作用，來自Nampt^+/+Il5^RFP-Cre（CD45.1/CD45.2）和Nampt^f/fIl5^RFP-Cre（CD45.2/CD45.2）小鼠的骨髓細胞以1:1的比例混合，并轉移到Rag2^–/–Il2rg^–/–小鼠中。六周后，從嵌合小鼠的腸道中分離出ILC2s，并通過同系標記追蹤其來源。結果顯示，來源于Nampt^f/fIl5^RFP-Cre骨髓的ILC2s數量以及產生Areg、IL-5和IL-13的ILC2s數量均較少。

給Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠和同窩對照組喂食DSS, Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠結腸炎更嚴重，結腸縮短，組織學嚴重程度增加，添加NMN后癥狀減輕，此外，NMN也使DSS處理的Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠ILC2s數量以及Areg、IL5和IL-13得到恢復。

圖7. ILC2s 中NAMPT缺乏可加重DSS誘導的結腸炎

小結

本研究揭示了慢性肝病加重UC的免疫代謝調控機制，發現腸道ILC2s通過感知肝臟來源的NAM來調控UC癥狀，為治療伴有慢性肝病的UC患者提供新的免疫代謝靶點。

參考文獻

Sensing of Liver-Derived Nicotinamide by Intestinal Group 2 Innate Lymphoid Cells Links Liver Cirrhosis and Ulcerative Colitis Susceptibility. Advanced Science. 2024

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繪譜幫你測

本研究使用麥特繪譜提供的¹³C標記的葡萄糖代謝流檢測服務，發現NAD⁺可以通過支持琥珀酸生成來維持ILC2s的正常功能，揭示了NAD^＋調控ILC2s的功能機制。麥特繪譜提供全面的代謝流檢測服務，可追蹤含¹³C和¹⁵N等被標記物100+種，全面覆蓋糖酵解和TCA循環通路、磷酸戊糖途徑、 氨基酸代謝、脂肪酸代謝、 一碳代謝、 核苷酸代謝通路等。豐富的個性化標記定制經驗–[U-¹³C₆]-Fructose，[U-¹³C₁₆]-Palmitate, [U-¹³C₃]-Serine,[U-¹³C₂]-Glycine, [U-¹³C₃]-Alanine, [U-¹³C₃]-Pyruvate, [U-¹³C₄]Malic Acid, [U-¹³C₁₈]-Oleic Acid, ¹³CO₂, ¹⁵N-NH₄CL, [1, 2-¹³C₂]-Glucose, [2,3,3-D₃]-Serine, [2,3-¹³C₂]Alanine, [1,2,3-¹³C₃]-Choline等。歷經數年項目積累，檢測各類貼壁細胞、懸浮細胞、菌體、培養液、線粒體、組織、糞便等樣本類型，涵蓋多發性骨髓瘤、肝癌、線粒體遺傳代謝病、免疫細胞活性與疾病、心血管疾病等多個研究方向，合作項目成果突出，文章平均IF >10+。

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