ACROBiosystems百普賽斯Star Staining新一代定點標記技術平臺開發的高質量熒光標記蛋白，可保持蛋白的天然構象，不影響蛋白活性，均一性好、批間一致性高?！靶羌墶钡难邪l實力，“星級”的技術平臺及產品，Star Staining專為CAR-T細胞質控和臨床樣本分析檢測而設計。
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嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫治療是一種新型的細胞免疫療法，其主要通過基因編輯技術使T細胞表達嵌合抗原受體(CAR)從而特異性識別并殺傷表達相應抗原的靶細胞進而治療疾病[1]。CAR的成功表達及靶抗原結合活性是CAR-T治療成功的先決條件，熒光標記靶點蛋白因簡單高效的流式檢測流程及避免了因使用二抗而產生的非特異背景，成為CAR表達檢測的關鍵原料，這對CAR-T細胞治療藥物的產品質控至關重要。然而高質量熒光標記蛋白的生產面臨著諸多難題，如標記后蛋白活性難以維持、產品的批間一致性難以控制等問題，目前市場上少有高質量的熒光標記蛋白產品可供選擇，實際上，這與熒光染料本身特性、以及使用的熒光標記技術密切相關。
圖1 熒光素類標記試劑的主要結構(左)和FITC的分子結構(右)
藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）從紅藻中分離純化獲得的一種常見染料，經激光激發后發出橙黃色熒光，最大發射波長為575 nm，PE具有吸光性能好和光量子產率高的特點。在流式細胞術檢測中，PE標記的蛋白適用于所有配備488/561nm氬離子激光器的流式細胞儀。水溶性好：通過親水性磺酸基的引入，提高熒光染料的水溶性，且儲存不易產生沉淀；
發射光譜窄：相較于傳統有機熒光染料，Alexa Fluor染料具有較窄的發射光譜，從而降低多熒光檢測的交叉串色。
抗淬滅、熒光強度強：光穩定性好，相關研究顯示，將Alexa Fluor和AMCA、 Lucifer Yellow、熒光素、羅丹明6G和Cy3 等熒光標記蛋白的信號強度對比分析發現，盡管這些染料具有與Alexa Fluor染料類似的發射和激發光譜，但在各染料的吸收和發射光譜范圍內Alexa Fluor染料量子產率更高、熒光強度更強、光穩定性更好（圖2）[3]，尤其適用熒光成像的應用場景。
非pH敏感：Panchuk-Voloshina[3]等對Alexa Fluor染料的發射光譜、吸收光譜和熒光信號強度進行研究時，證明Alexa Fluor染料對pH的變化不敏感，可在 pH為4-10下保持穩定結構和強熒光信號。
接下來，一起來看幾種常見的Alexa Fluor染料分子吧~
1）Alexa Fluor 488：Alexa Fluor 488的發射光譜與FITC幾乎一致，經激光激發后發出綠色熒光，最大發射波長為519 nm，但其熒光強度和穩定性要優于FITC，且在pH 4-10范圍內能保持較好的光穩定性。
2）Alexa Fluor 555：Alexa Fluor 555的熒光光譜和Cy3非常接近，最大發射波長為565nm,熒光更強，穩定性更好，可耐受更長的熒光信號捕捉時間。
3）Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一種明亮的紅色熒光染料，其最大發射波長為668 nm，一般在流式細胞儀的FL4通道檢測。Alexa Fluor 647具有熒光量子產率高、光穩定性好、pH耐受范圍廣和熒光不易淬滅等特點，是APC和Cy5的優質替代品。
蛋白質熒光染料因其檢測靈敏度高及可視化的獨特優勢，日益廣泛地應用于生物分析，蛋白質組的識別和各項生理標檢測等領域，熒光標記靶點蛋白也已成為生物醫藥行業，如細胞治療藥物開發過程中的關鍵檢測原料。因此，搭建通用性的蛋白質熒光定點偶聯技術平臺及開發不同熒光染料的定點標記技術，是滿足當前市場對熒光標記類蛋白產品日益增長的質量要求和多樣化需求的必經之路。
為滿足細胞治療產品質控和臨床樣本分析更高質量標準的檢測要求，填補蛋白質定點熒光標記產品的市場空白，ACROBiosystems在多年技術經驗積累的基礎上，不斷更新完善，以“星級”研發實力，成功搭建了“星級標準”的Star Staining新一代熒光定點標記技術平臺，與傳統非定點蛋白質標記相比，Star Staining定點標記技術可大程度的維持蛋白的天然構象和活性，并保證標記產品性能的高度均一性和批間一致性。
依托Star Staining定點標記技術平臺，ACROBiosystems開發了一系列獨具特色的Star Staining系列熒光定點標記蛋白產品，包括Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 647、FITC、APC、PE等多種熒光類型，覆蓋CD19，BCMA，GPC3，MSLN，CD22，CD33，CD7，CD5等熱門CART靶點蛋白，助力細胞治療藥物的研發進程。
“星級”技術平臺
蛋白特定位點標記
標記位點遠離活性中心，維持蛋白天然空間構象
高效生物正交反應，無非特異信號
產物均一性好、批間一致性高
“星級”產品特色
采用定點標記技術，不影響蛋白天然構象，高蛋白活性
高靈敏度和高特異性，經類CAR細胞批檢驗證
高度均一，極低非特異信號，經PBMC雙染批檢放行
高批間一致性，高水平滿足臨床樣本分析檢測要求
高穩定性（經加速、凍融驗證）
熒光類型豐富（FITC\PE\APC\Alexa Fluor 488\555\647）
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驗證數據
>>>明星產品——Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. BCA-HA2H6)
Anti-BCMA CAR-293 cells were stained with Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein (Cat. No. BCA-HA2H6) and negative control protein respectively, Alexa Fluor 555 signal was used to evaluate the binding activity.
>>>明星產品——PE-Labeled Human Siglec-2 / CD22 Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. SI2-HP2H5）
5e5 of anti-CD22 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and negative control protein respectively (Fig. C and B), and non-transfected 293 cells were used as a control (Fig. A). PE signal was used to evaluate the binding activity.
5e5 of PBMCs were stained with PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and anti-CD3 antibody, washed and then analyzed with FACS. FITC signal was used to evaluate the expression of CD3+ T cells in PBMCs, and PE signal was used to evaluate the non-specific binding activity to PBMCs.
>>>明星產品——APC-Labeled Human CD19 Protein, His Tag star staining（Cat. No. CD9-HA2H9）
Anti-CD19 CAR-293 cells were stained with APC-Labeled Human CD19 (20-291) Protein (Cat. No. CD9-HA2H9) and negative control protein respectively, APC signal was used to evaluate the binding activity.
>>>高批間一致性
不同熒光標記產品的不同批次蛋白活性可保持一致，具有高批間一致性，以確保長期用于CAR-T細胞質控和臨床樣本分析中檢測結果的穩定性和可靠性。
Binding activity of different lots of FITC-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HF2H3), AF555-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HA2H6) and PE-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HP2H7) against anti-BCMA CAR-293 cells was evaluated by flow cytometry. The result shows very high batch-to-batch consistency.
>>>高穩定性
25℃條件下加速48h和反復凍融三次，依然可保持較高的生物活性，顯示出蛋白的高度穩定性，可放心儲存和使用。
PE-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HP2H7) and FITC-Labeled Human BCMA (Cat. No.BCA-HF2H3) at 25℃ for 48 hours and freeze-throw cycles are stable without performance reduction.
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參考文獻
[1] Yonghong Li, Yan Huo, Lei Yu, Junzhi Wang, Quality Control and Nonclinical Research on CAR-T Cell Products: General Principles and Key Issues.https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.12.003.
[2] 王洪蘇, 關桂靜, 劉金香. Alexa Fluor熒光標記在細胞學和分子生物學研究中的應用[J]. 中國生物工程雜志, 2015, 35(9):71-71.
[3] Panchuk-Voloshina N, Haugland RP, Bishop-Stewart J, et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 1999;47(9):1179-1188. doi:10.1177/002215549904700910
[4] Dean KM, Palmer AE. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nat Chem Biol. 2014;10(7):512-523. doi:10.1038/nchembio.1556